槲皮素锗对多种肿瘤细胞增殖的抑制作用*

侯钰佩，郭阿丽，翟广玉#，马 岩，马海英，王 鹏，朱 玮，渠文涛

1)郑州大学护理学院 郑州 450052

2)郑州大学附属郑州中心医院 郑州 450007

3)郑州大学药学院 郑州 450001

人体内的自由基与多种疾病的发生有关[1]。槲皮素是天然的自由基清除剂[2]，具有止咳、平喘、抗炎、抗病毒和抗癌等作用[3]。中药配位化学认为，中药的有效成分不单纯是有机分子，也不单纯是微量元素，而主要是有机分子与微量元素组成的配合物。已有研究[4-7]显示槲皮素可与多种金属离子螯合形成稳定的配合物，并可引起肿瘤细胞生长受抑或凋亡。该研究中作者合成了槲皮素锗，并观察了其对多种肿瘤细胞增殖的抑制作用。

1 材料与方法

1.1 材料 试剂:槲皮素(自制)，氧化锗(试剂)，RPMI 1640培养基(HyClone，北京赛默飞世尔生物化学制品有限公司)，青霉素、链霉素(HyClone，SH40003-12)，胎牛血清(无噬菌体，低内毒素，杭州四季青生物工程材料有限公司)，胰蛋白酶(吉诺生物医药技术有限公司)，二甲基亚砜(DMSO，Sigma公司)，四甲基偶氮唑蓝(MTT，Sigma公司);其他试剂均为分析纯。细胞株:人子宫颈癌细胞Hela、人肺腺癌细胞SPC-A-1、人食管癌细胞EC9706与人前列腺癌细胞PC-3购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库。仪器:FTS-3000型红外光谱仪，Perkin-400CHN型元素分析仪，德国耐驰STA 409 PC/PG差热分析仪，UV-240型紫外-可见分光光度计(日本岛津公司)，CJ-2F超净工作台(苏州冯氏实验动物设备有限公司)，二氧化碳培养箱(美国SIM公司)，倒置显微镜(德国莱卡公司)，Spectra Mr型全波长酶标仪(美国Dynex公司)。

1.2 槲皮素锗的制备 根据文献[7]的方法适当改进。取1 mmol槲皮素，1 mmol氧化锗，加入50 mL甲醇，甲醇钠调节pH为8.5，于装有磁力搅拌器和冷凝管的三口烧瓶中，加热回流6 h。用硅胶G板监控反应进程，待反应完成时，停止回流。反应液装入聚酰胺层析柱，先用水冲洗，再用不同浓度的甲醇溶液梯度洗脱，收集设定区间洗脱液，旋转蒸发仪蒸干有机溶剂得橘黄色固体，用甲醇重提，得深橘黄色固体。所得固体经元素分析，紫外、红外光谱分析及热分析鉴定为目标产物后，用灭菌水配制成10 mmol/L的原药贮存液，4℃保存，临用时以RPMI 1640培养基稀释，0.22 μm微孔滤膜过滤。

1.3 槲皮素锗对 Hela细胞、SPC-A-1细胞、EC9706细胞和PC-3细胞增殖的影响 分别取处于对数生长期的上述细胞，调整细胞密度为每孔6×103个，接种于96孔板中，体积分数5%CO2、37℃、饱和湿度孵育箱中培养。待细胞贴壁后，吸弃培养液，实验组加入RPMI 1640培养基稀释的槲皮素锗至终浓度分别为10、100 μmol/L，溶剂对照组加入完全培养基，每孔终体积为200 μL，每组设6个复孔。培养72 h后取出培养板，倒置显微镜下进行形态学观察并照相。分别加入5 g/L MTT，20 μL/孔，继续培养4 h，吸弃上清液后加入DMSO 150 μL/孔，振荡10 min，使结晶充分溶解后，采用酶标仪检测波长570 nm处各孔光密度值。细胞增殖抑制率(IR)=1－(药物组光密度值/对照组光密度值)×100%。

1.4 统计学处理 采用SPSS 13.0处理数据，应用两独立样本t检验比较不同浓度槲皮素锗对4种细胞IR的差异，检验水准α=0.05。

2 结果

随着槲皮素锗浓度的增加，细胞体积急剧变小、变形，贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞核质浓缩或呈碎块状。以SPCA-1和EC9706细胞最为典型，见图1。不同浓度槲皮素锗对4种肿瘤细胞的IR见表1。

图1 不同浓度槲皮素锗处理后SPC-A-1细胞(A)和EC9706细胞(B)形态的变化(×200)

表1 不同浓度的槲皮素锗对4种肿瘤细胞的IR(n=6) %

3 讨论

槲皮素可与许多金属离子螯合形成稳定的配合物[4]。Tan等[5]发现槲皮素锌和槲皮素镍能够嵌入DNA的碱基对中，使细胞核皱缩，引起细胞凋亡。Zhou等[6]发现槲皮素铜与DNA有相互键合作用，可抑制癌细胞的恶性生长。Ferrer等[7]发现槲皮素钒具有抗骨肿瘤的作用。锗是一种具有多种生物活性的微量元素。有机锗具有调节人体免疫和造血机能、清除自由基及抗癌等功效[8]。该研究结果显示，槲皮素和锗在碱性条件下，可以生成槲皮素锗配合物，并通过元素分析，紫外、红外光谱分析及热分析鉴定为目标产物。MTT实验证明，合成的槲皮素锗体外对Hela细胞、SPC-A-1细胞、EC9706细胞和PC-3细胞的增殖均有抑制作用，以高浓度组作用更为明显，提示槲皮素锗具备广泛的抗肿瘤作用，具有开发研制为抗肿瘤药物的可能，其抗肿瘤机制值得进一步研究。

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