眼针对腹泻型肠易激综合征模型大鼠结肠组织5-HT表达的影响

王艳杰，张立德，王 健，关洪全，刘旭东，刘慧慧，柴纪严，赵金茹，王德山

(辽宁中医药大学，沈阳 110032)

近年来对于5-HT与IBS关系的研究已成为热点。因此本课题组通过建立腹泻型肠易激综合征(D-IBS)大鼠模型，并观察眼针对该模型大鼠结肠组织中5-HT表达的影响，探索眼针对IBS治疗的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级雄性Wistar大鼠30只，北京维通利华实验动物技术有限公司提供(许可证编号SCXK(京)2007-0001)，体重 220g±20g。

1.2 主要试剂和仪器

大鼠 5-HT ELISA试剂盒(美国 ADL公司，Catalogue No:QRCT-301330121013EIA/UTL);兔抗大鼠5-HT抗体(美国 ADL公司)、SABC试剂盒和DAB等(武汉博士德生物工程有限公司)。2010型anthos酶标仪(奥地利安图斯);RM2235型手动石蜡切片机，EG1150C型包埋机，HI1220型烘片机(德国LEICA)，BX51型OLYMPUS反射荧光显微镜(日本OLYMPUS)。

1.3 动物分组、模型建立和评价

30只SPF级Wistar大鼠按照随机数字法分为正常组、IBS模型组、眼针组3组，每组10只，分笼饲养，标准颗粒饲料喂养7d以适应实验室环境，然后开始建立D-IBS动物模型。其中IBS模型组和眼针组采用慢性应激结合束缚方法建立D-IBS模型。D-IBS的模型建立和评价参考王艳杰等［1］的报道。以 Katz 等慢性应激法［2］与 Williams等［3］束缚方法结合建立D-IBS模型。在18d中让大鼠随机循环接受6种不同的应激刺激，包括:①冷水游泳(14℃，5min);②夹尾(180 s);③禁水(24 h);④禁食(24 h);⑤电击(电压为 30 V，电击 5 s，间歇 5 s，共进行120 s);⑥高温(温箱中40℃30min);每天随机接受1种刺激，18d内平均每种刺激3次，同时每天给予30%水合氯醛(3ml/kg)腹腔注射麻醉，用胶带束缚前肩、前上肢及胸部，限制其搔抓头面部，束缚时间1h。观察大鼠一般状态、结肠组织病理学、结肠转运功能和肠道敏感性等变化对模型进行评价。

1.4 眼针治疗方法

模型通过评价后，眼针组给予眼针治疗每日1次，连续针刺 7d。治疗方法参考王德山［4］等的报道。眼针取穴及刺法:用31号13mm毫针，于大鼠眶周2mm处针刺，定位参照人体取穴方法，取下焦区、大肠区、肝区、脾区针刺。通过触摸大鼠眼周，确定眼眶眶缘的位置，并在标记好的穴区部位，眼眶眶缘上1mm～2mm部位采用斜刺方法进行针刺。具体方法:左眼按照顺时针方向(右侧按逆时针方向)，从该穴区的起始定位线处斜向下45°角向终止定位线方向进针，刺入真皮，达到皮下组织，进针2mm左右，留针20min。留针期间进行刮柄刺激，在留针10min时，采用刮柄法行针1次，刮针柄5下以加强刺激。

1.5 肠道敏感性(腹部回缩反射)检测

治疗结束后采用腹部回缩反射(AWR)测定大鼠肠道敏感性。实验前禁食12h，乙醚麻醉状态下将带有球囊的导尿管置入距肛门内1cm处并固定于尾部，将大鼠限制在特制的透明塑料笼(20cm×6cm×8cm)内，只能前后运动而不能转身。清醒30min后向球囊内分别注入温水扩张结、直肠(CRD)，观察引起大鼠腹部抬起(结肠扩张时腹肌收缩并抬离桌面)以及背部拱起的压力阈值(结肠扩张时骨盆抬起，身体呈弓状)，进行行为评估。

1.6 血清和结肠5-HT含量的变化检测

治疗结束后，20%乌拉坦(5ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠，腹主动脉取血3ml离心分离血清。在取血后，打开大鼠腹腔取结肠组织，用预冷生理盐水洗去血液，滤纸吸干，按1∶9(结肠组织:生理盐水，W∶V)加入生理盐水制备组织匀浆，离心取上清。取血清和上清液按照试剂盒说明书进行ELISA实验，然后利用全自动酶标仪，在450nm处测定各孔的OD值，采用CurveExpert 1.3进行标准曲线的绘制，并计算出对应的浓度值。

1.7 结肠5-HT表达的变化检测

利用多聚赖氨酸进行防脱片处理，切片常规脱蜡至水。3%H2O2灭活内源性酶，蒸馏水洗3次。热修复抗原，冷却后 PBS洗涤1～2次。滴加5%BSA封闭液，室温20min。滴加适当稀释的一抗(1∶100)，4℃过夜。PBS洗2min/3次，滴加生物素化山羊抗小鼠 IgG，20℃ ～37℃孵育 20min。PBS洗5min/2次，滴加试剂 SABC在室温下孵育 30min。PBS洗5min/4次，DAB显色，室温显色，镜下控制反应时间。蒸馏水洗涤，苏木素轻度复染、脱水、透明、封片，显微镜观察并拍照。采用 BI2000医学图像分析系统进行图像分析，选取200倍图像，观察结肠黏膜固有层和肌层，细胞质呈棕黄色为5-HT阳性表达细胞，每张切片随机选取3～5个高倍视野测定平均光密度值，平均光密度值代表阳性表达参数，平均光密度值越大，阳性表达越强。

1.8 统计方法

实验数据运用SPSS13.0处理，以均数±标准差(珋x±s)表示实验结果，进行多组数据的方差分析，组间比较采用LSD法。P＜0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 眼针对D-IBS模型大鼠肠道敏感性的影响

表1显示，与正常组比较，D-IBS模型组背部拱起阈值和腹部抬起阈值均显著降低(P＜0.01);眼针治疗结束后，和D-IBS模型组比较，眼针组背部拱起阈值和腹部抬起阈值均显著升高(P＜0.01)。

表1 眼针对D-IBS模型大鼠背部拱起和腹部抬起阈值的影响(珋x±s)

2.2 眼针对D-IBS模型大鼠血清和结肠5-HT含量的影响

表2显示，与正常组比较，D-IBS模型组5-HT水平显著升高 (P＜0.01);与D-IBS模型组比较，眼针组5-HT水平降低 (P＜0.01)。

表2 眼针对D-IBS模型大鼠血清和结肠5-HT含量的影响(珋x±s)

2.3 眼针对D-IBS模型大鼠结肠组织5-HT表达的影响

图1显示，5-HT免疫组化染色呈棕黄色反应，各组标本均可见免疫染色阳性细胞，阳性细胞主要表达在结肠固有层;与正常组比较，D-IBS模型组细胞表现为细胞着色较深，染色强度增强，平均光密度值显著升高(P＜0.01);而与D-IBS模型组比较，眼针组免疫组化染色强度降低，表现为着色较浅，平均光密度值显著降低(P＜0.01)。

图1 眼针对IBS模型大鼠结肠5-HT免疫组化染色强度的影响

3 讨论

眼针疗法是我院著名老中医彭静山先生于1974年开创的一种独特的针刺疗法［5、6］。近 40年来，经千万病例证实眼针对30余种疾病确有疗效，特别对急性脑中风及顽固性疼痛等具有“随针起效”的显著疗效。彭老是根据中医基础理论，结合“五轮八廓”、“八卦”学说创立的眼针疗法，他将眼周分为“八区十三穴”，并认为“八区十三穴络脑通脏腑”，通过观察穴区白睛脉络形态和颜色以诊断疾病称“观眼识证”，依据“观眼识证”及脏腑辨证取穴针刺以治疗疾病。因此眼针是从整体观念出发，认为眼与五脏六腑之间依靠经络的沟通、联络具有密切联系，使全身构成一个有机的统一整体，维持着人体的正常生命活动，若脏腑经络功能失调，则可影响到眼睛，使眼睛发生各种变化。在眼眶边缘穴区施针，就可以达到疏通经络、调整脏腑经络气血、平衡阴阳、调节脏腑治疗全身疾病的目的。为了进一步探索眼针是如何作用于内脏及其调整胃肠道功能的机制，本课题组提出五脏六腑之精华皆注于目，脏腑功能气血盛衰均与眼穴相关联，眼针刺激外周相关穴位，能够启动靶器官神经递质、细胞因子等释放和分泌，从而调控局部血运与代谢、改善其功能效应，达到治疗效果的假说。为了证明这一假说本课题组建立了D-IBS大鼠模型，并采用眼针治疗，通过测定结肠组织5-HT的表达变化，来探索眼针的作用机制，从而为丰富眼针的中医理论基础内涵提供现代医学依据。

表3 眼针对D-IBS模型大鼠结肠5-HT免疫组化染色强度的影响(珋x±s)

IBS是一组以腹痛或腹部不适，同时伴有排便习惯改变和(或)大便性状异常为主要症状的肠道功能性疾病。越来越多的研究表明，IBS的发病与精神因素和肠道的刺激因素有关。应激可通过脑-肠轴影响胃肠道的运动、分泌、感觉功能。本实验采用慢性应激结合急性束缚的方法建立了由精神应激引起的IBS大鼠模型，较好地模拟了人类IBS的重要病因-精神创伤。本实验在造模过程中，在应激刺激下大鼠逐渐出现躲避、畏惧、嘶叫、激惹及好斗倾向，受刺激时稀便率增加，体重增长率降低，与人类IBS有一定的相似性，说明造模成功。该模型中医辨证属于肝郁脾虚型，因此本实验以整体观念为理论基础，以辨证论治为治疗原则，结合眼针选穴方法，确定疏肝健脾为治疗法则，选取下焦区、大肠区、肝区、脾区为治疗腧穴，共奏调理脏腑、平衡阴阳之效。

内脏敏感性增加是 IBS患者基本的病理生理改变。包括便秘型和腹泻型患者都有腹痛或腹部不适，肛门直肠测压显示两型 IBS患者都存在内脏高敏感性。本实验结果显示，与正常组比较，D-IBS模型组背部拱起阈值和腹部抬起阈值均显著降低，说明模型制备成功;眼针治疗结束后，与D-IBS模型组比较，眼针组背部拱起阈值和腹部抬起阈值均显著升高，说明针刺眼周的相应穴区能够调控肠道功能，降低肠道敏感性，但其具体机制仍需进一步探讨。

5-羟色胺又称为血清素(serotonin)，来源于色氨酸的代谢，人体大约95%的5-HT来源于肠道，其中90%的5-HT储存于肠嗜铬细胞(enterochromaffin cell，EC)中，10%存在于肠神经系统(enteric nervous system，ENS)，且二者均可摄取色氨酸或胺前体在色氨酸羟化酶催化下合成5-HT［7］。外周神经系统的5-HT几乎全部由位于胃肠腺腔底部的EC产生、贮存和再摄取［8］。近来有报道［9、10］，腹泻型 IBS 患者的血浆5-HT浓度较健康人明显增高。与正常组比较，腹泻型、便秘型 IBS分泌5-HT的 EC细胞数量明显增多，差异有显著性。免疫组化染色显示，IBS组EC细胞内合成的5-HT增加，电镜显示肠道EC细胞功能活跃。EC细胞对肠腔内压力和化学刺激非常敏感，一旦肠腔内压力升高即可分泌5-HT，作用于黏膜下传入神经神经元上的5-HT受体，激发蠕动反射并调节肠道分泌功能。临床上［11］慢传输性便秘、IBS、功能性腹胀等胃肠功能性疾病患者常伴有明显的情绪精神状态异常，而一些针对5-HT信号系统的抗抑郁药、抗焦虑药也能有效缓解IBS，这又从另一个侧面提示5-HT在胃肠道功能性疾病中扮演了重要角色。我国学者李兆申等［12］发现与正常组比较 C-IBS、D-IBS肠道分泌5-HT的 EC细胞数量明显增加，电镜下见其分泌功能状态活跃。Spiller等［13］报道 IBS患者的直肠活检标本中，含5-HT的EC细胞数量增多，可见EC细胞与 IBS的发病有一定的联系。

本课题的实验研究结果表明，与正常组比较，DIBS模型组血清和结肠组织5-HT水平显著升高，说明腹泻型肠易激综合征模型大鼠肠道合成和分泌5-HT增多。而眼针治疗后，与D-IBS模型组比较，眼针组血清和结肠组织5-HT水平降低，说明通过辨证取穴，针刺眼周下焦、大肠、脾和肝区等穴区能够调控肠道5-HT的合成和分泌，从而调控肠道功能。本课题实验结果显示，各组标本均可见5-HT免疫染色阳性细胞，主要表达在结肠固有层;与正常组比较，D-IBS模型组细胞染色强度增强，表现为细胞着色较深，进一步说明腹泻型肠易激综合征模型大鼠肠道 EC细胞数量增加，合成和分泌5-HT增多。而与D-IBS模型组比较，眼针组免疫组化染色强度降低，表现为着色较浅，说明眼针治疗能够减少肠道EC细胞数量，减少5-HT的合成和分泌。因此说明通过辨证取穴，眼针刺激外周相关穴位，启动了靶器官即肠道的5-HT等神经递质的释放和分泌，从而调控了结肠的运动与代谢功能，改善其功能效应，达到了治疗效果，为中医理论中五脏六腑之精华皆注于目，脏腑功能气血盛衰均与眼穴相关联，眼针“八区十三穴络脑通脏腑”提供了现代生物学支撑依据。

［1］ 王艳杰，王德山，关洪全，等.眼针对腹泻型肠易激综合征大鼠血清和结肠组织中P物质及血管活性肠肽含量的影响［J］.针刺研究，2010，35(1):8-11.

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