Clostridium bolteae ATCC BAA-613 D-塔格糖3-差向异构酶的诱导表达、纯化及活性研究

储菲菲，沐万孟，邢庆超，周榴明，张 涛，江 波，*

（1.江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡 214122;2.罗盖特美国公司，基奥卡克52632，美国)

Clostridium bolteae ATCC BAA-613 D-塔格糖3-差向异构酶的诱导表达、纯化及活性研究

储菲菲1，沐万孟1，邢庆超1，周榴明2，张 涛1，江 波1，*

（1.江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡 214122;2.罗盖特美国公司，基奥卡克52632，美国)

D-塔格糖3-差向异构酶是生物法生产新型功能性因子D-阿洛酮糖最为有效的酶。一种新型的能够编码D-塔格糖3-差向异构酶的基因CLOBOL_00069被克隆，它来源于Clostridium bolteae ATCC BAA-613。以pUC57为克隆载体，以pET-22b（+)为载体质粒，E.coli BL21（DE3)为宿主细胞，构建了基因重组工程菌。IPTG诱导剂诱导目的蛋白的表达;通过镍柱亲和层析，杂蛋白与目的蛋白得到了很好的分离。对纯化的重组蛋白样品进行SDS-PAGE分析，在约32ku处出现明显的特征条带。通过活性研究表明，Clostridium bolteae ATCC BAA-613 DTEase属于DTEase家族，并具有较高的生物转化率，反应10h后转化率达到20%。

D-塔格糖3-差向异构酶，D-阿洛酮糖，基因重组，亲和层析

D-阿洛酮糖是一种在自然界中较为稀有的天然己酮糖，属于稀有糖的一种，是D-果糖的差向异构体。D-阿洛酮糖是近年发现的一种具有特殊保健功能的新型功能性因子，它的热量值只有0.007kcal/g[1];具有降低血糖的生理功能[2]和可抑制肝脏脂肪合成酶活性，减少脂肪沉积的作用[3];体外实验发现它具有神经保护作用，可抑制6-羟基多巴胺诱导的小鼠嗜铬细胞瘤细胞凋亡[4];与D-葡萄糖和D-果糖相比，具有较强的清除活性氧的能力[5]。所以，由于其优良的功能性质而受到人们的广泛关注，具有巨大的市场前景。D-塔格糖3-差向异构酶（D-tagatose 3-epimerase，DTE，EC5.3.1.-)家族则是实现D-阿洛酮糖生物法生产的重要生物催化剂，可以催化D-果糖异构化为D-阿洛酮糖。因此鉴于D-塔格糖3-差向异构酶的重要应用价值，国内外研究者已发现了几种属于DTEase家族的酶，如Pseudomonas cichorii DTEase[6-8]、AgrobacteriumtumefaciensDPEase[9-10]、Rhodobacter sphaeroidesSK011 DTEase[11-12]和Clostridium cellulolyticumDTEase[13]，它们异构化果糖的效率分别为20%、32%、17%和30%。本文以Clostridium bolteaeATCC BAA-613 DTE基因组为模板，通过基因合成获得DTEase的编码基因CLOBOL_ 00069，以pET-22b（+)为载体，构建获得重组质粒pET22b-cb-dte，并在大肠杆菌中实现成功表达，表达产物DTEase被鉴定具有生物活性，可以由D-果糖差向异构化为D-阿洛酮糖，证明Clostridium bolteaeDTEase属于DTEase家族，并具有较高的生物转化率。

1 材料与方法

1.1 实验材料

载体E.coliDH5α、载体E.coliBL21（DE3)、T4 DNA连接酶、DNA聚合酶、脱氧核苷三磷酸、质粒抽提试剂盒 均购自生工生物工程（上海)有限公司;表达载体pET-22b（+)、克隆载体pUC57 均购自上海闪晶分子生物技术有限公司;Wide Range DNA Marker（500～15000bp)、限制性内切酶Nde I和Xho I、Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside（IPTG)等 购于TaKaRa（宝生物工程有限公司，大连);低分子量标准蛋白Marker 购于中科院上海生物化学研究所;Chelating Sepharaose Fast Flow 购自GE（乌普萨拉，瑞典);D-阿洛酮糖标准品 购于Sigma公司。

1.2 实验方法

1.2.1Clostridium bolteaeATCC BAA-613 DTEase基因的克隆 上海闪晶分子生物技术有限公司通过基因合成技术合成目的基因CLOBOL_00069。同时，将Nde I和Xho I酶切位点引入上下游引物5’端。然后再将其产物克隆入pUC57克隆载体上，以此得到重组质粒pUC57-cb-dte。

1.2.2Clostridium bolteaeATCC BAA-613 DTEase基因的亚克隆 用Nde I、Xho I双酶切表达载体pET-22b（+)和重组质粒pUC57-cb-dte。而后，将回收到的目的片段与表达载体相连，连接产物转化至宿主菌E.coliDH5α，并涂布于LB固体培养基上，于37℃培养12h。LB固体培养基配比：胰蛋白胨1%（w/v)，酵母提取物0.5%（w/v)，氯化钠1%（w/v)，琼脂粉1.5%（w/v)。挑取白色菌落37℃培养，抽提质粒进行酶切鉴定。

1.2.3Clostridium bolteaeATCC BAA-613 DTEase基因工程菌的构建 通过1.2.2中的筛选与鉴定，获得重组质粒阳性克隆pET22b-cb-dte，将该重组质粒转化至表达宿主菌E.coliBL21（DE3)中，以此获得基因工程重组菌E.coliBL21/pET22b-cb-dte。

1.2.4Clostridium bolteaeATCC BAA-613 DTEase的诱导表达优化 挑取基因工程菌E.coliBL21/pET22bcb-dte的单菌落，接种于小体积的含氨苄抗生素（终浓度50μg/mL)的LB液体培养基中进行活化，在200r/min，37℃条件下振荡培养10h。接着，再按4%接种量将其接种至大体积的LB培养基中，同条件下振荡培养，当菌体的OD600值为0.6～0.8时，加入一定浓度的IPTG低温诱导蛋白的表达。为了得到大量的目的蛋白，因此选择了诱导剂浓度、诱导时间、诱导温度等三个因素对诱导表达进行初步的优化。

1.2.4.1 诱导剂浓度对目的蛋白表达的影响 加入终浓度分别为0、0.1、0.5、1、1.5、2mmol/L的诱导剂IPTG，固定其他条件：在200r/min振荡条件下，诱导温度28℃，诱导时间5h。

1.2.4.2 诱导时间对目的蛋白表达的影响 选择不同的诱导时间0、1、2、3、4、5、6h，固定其他条件：在200r/min振荡条件下，诱导剂IPTG浓度0.5mmol/L，诱导温度28℃。每隔1h取菌液进行SDS-PAGE电泳分析。

1.2.4.3 诱导温度对目的蛋白表达的影响 选择不同的诱导温度0、10、15、20、28、35℃，固定其他条件：在200r/min振荡条件下，诱导剂IPTG浓度0.5mmol/L，诱导时间5h。

1.2.5 表达产物的SDS-PAGE验证 取诱导后的菌液，加入SDS样品缓冲液，混匀后煮沸几分钟，高速离心约1min，取20μL上清液进行SDS-PAGE电泳分析（4%浓度的浓缩胶，12%浓度的分离胶)。

1.2.6Clostridium bolteaeATCC BAA-613 DTEase的分离纯化 低温离心（8000×g，15min，4℃)收集菌体，然后以缓冲液（100mmol/L NaCl，50mmol/L Tris-HCl，pH7.5)重悬菌体，超声波破碎大肠杆菌细胞5min（300W，开1s/关1s)后，低温离心（10000×g，20min，4℃)弃细胞碎片，收集上清液进行以下层析纯化。

采用Ni2+-Chelating Sepharose Fast Flow亲和层析柱（1.0cm×10.0cm)，对重组的Clostridium bolteaeDTEase进行纯化。上柱前预先用平衡液（100mmol/L NaCl，50mmol/L Tris-HCl，pH7.5)平衡层析柱，蛋白酶液上柱后以洗涤液（平衡液+50mmol/L咪唑)洗脱杂蛋白，再用洗脱液（平衡液+500mmol/L咪唑)洗脱目的蛋白，最后用透析液（50mmol/L NaCl，50mmol/L Tris-HCl，pH7.5)对目的蛋白酶液进行透析。以上操作均在4℃低温条件下进行。所得纯化的重组蛋白用SDS-PAGE进行电泳分析。

1.2.7 Folin-酚法测定纯化的重组蛋白浓度 取0.2mL纯化过的酶液，加水补足至1.0mL，然后加5mL试剂甲，在旋涡混合器上迅速混合，于室温20～25℃放置10min。再逐管加入0.5mL试剂乙（Folin-酚试剂)，同样立即混匀，然后在室温下放置30min，最后于650nm处测定管中溶液的吸光度值。蛋白浓度测定按《蛋白质技术手册》[13]设计操作，根据标准曲线算出重组蛋白浓度。

1.2.8Clostridium bolteaeATCC BAA-613 DTEase的酶活性鉴定 为鉴定该酶的生物活性，利用全细胞Clostridium bolteaeATCC BAA-613 DTEase和纯化后的Clostridium bolteaeATCC BAA-613 DTEase进行果糖转化实验。DTEase可催化D-果糖生成D-阿洛酮糖，而D-果糖和D-阿洛酮糖含量可通过高效液相色谱法进行测定。HPLC条件：Waters Sugarpak-1钙型阳离子交换柱，Agilent 1200高效液相色谱仪，Shodex示差折光检测器。流动相：纯水;流速：0.4mL/min;柱温：85℃;进样量：10μL。

1.2.9Clostridium bolteaeATCC BAA-613 DTEase的催化效率研究 DTEase可催化D-果糖生成D-阿洛酮糖，将D-果糖（200mg/mL)，Tris-HCl缓冲液（50mmol/L，pH7.0)和1U/mL的酶混合，45℃水浴，120r/min振荡条件下进行转化反应，每间隔1h取样测定生成的D-阿洛酮糖的含量。底物D-果糖与产物D-阿洛酮糖含量可通过HPLC进行测定。

2 结果与讨论

2.1 重组表达质粒的构建、酶切鉴定及序列分析

能够编码Clostridium bolteaeATCC BAA-613 DTEase的目的基因CLOBOL_00069通过基因合成获得，将其克隆至pUC57载体质粒中，再经亚克隆将目的片段连接至表达载体质粒pET-22b（+)中，连接产物转化至宿主菌E.coliDH5α，挑取白色菌落37℃培养，抽提质粒进行鉴定（图1)。

图1 Clostridium bolteae ATCC BAA-613 DTEase质粒抽提鉴定Fig.1 Plasmid extraction analysis of Clostridium bolteae ATCC BAA-613 DTEase

将获得的重组表达质粒pET22b-cb-dte经Nde I、Xho I双酶切和Nde I单酶切，酶切后将产物进行琼脂糖凝胶电泳，pET22b-cb-dte限制性酶切鉴定结果见图2。重组质粒pET22b-cb-dte经双酶切后得到pET-22b（+)表达载体线性片段和插入的目的基因CLOBOL_00069，目的基因片段大小约为800bp，该片段与编码Clostridium bolteaeATCC BAA-613 DTEase基因大小相同，表明重组质粒构建成功。

图2 重组质粒pET22b-cb-dte鉴定酶切图Fig.2 Restriction enzymatic analysis of recombinant plasmid pET22b-cb-dte

通过NCBI Blast分析，目的基因编码的氨基酸序列与之前报道过的DTEase家族Agrobacterium tumefaciensDPEase，Pseudomonas cichoriiDTEase，Rhodobacter sphaeroidesDTEase和ClostridiumcellulolyticumDTEase比较，有相对较高的氨基酸序列同源性，分别为49.48%、35.84%、29.10%和51.86%。

2.2 基因工程菌的诱导表达优化

为了得到大量的目的蛋白，对重组菌E.coliBL21/ pET22b-cb-dte的诱导表达进行了初步的优化，因此选择了诱导剂浓度、诱导时间、诱导温度等三个因素来进行研究。

2.2.1 诱导剂浓度对重组菌表达的影响 选择加入不同终浓度的诱导剂IPTG，固定其他条件：在200r/min振荡条件下，诱导温度28℃，诱导时间5h。从图3可以看出，最适的IPTG终浓度为0.5mmol/L，IPTG的浓度过高将导致杂蛋白的过量表达，相应的酶活将降低。

图3 IPTG终浓度对重组菌表达的影响Fig.3 Effect of IPTG concentration on the expression of recombinant strains

2.2.2 诱导时间对重组菌表达的影响 在28℃温度下，0.5mmol/L的IPTG诱导5h可达到最高表达产物量（图4)，5h以后，随着诱导时间的延长，诱导量不再增加。表达产物SDS-PAGE分析结果所示，重组菌株经诱导表达后，约在32ku处明显出现特征蛋白条带。

图4 重组质粒pET22b-cb-dte在E.coli BL21（DE3)中的表达Fig.4 pET22b-cb-dte expression in E.coli BL21（DE3)

2.2.3 诱导温度对重组菌表达的影响 选择不同的诱导温度，固定其他条件：在200r/min振荡条件下，诱导剂IPTG浓度0.5mmol/L，诱导时间5h。从图5可以发现，高温诱导将导致酶活的迅速下降，所以为了防止目的蛋白DTEase形成大量包涵体，使用低温诱导温度。但是诱导温度过低，也不利于目的蛋白大量表达，所以选择的最适诱导温度为20℃。

2.3 Clostridium bolteae ATCC BAA-613 DTEase的纯化与蛋白含量测定

纯化后的重组DTEase样品进行SDS-PAGE分析（图6)，该重组DTEase的亚基分子量约为32ku，进一步说明外源基因在宿主菌中得到了正确的表达。同时，目的蛋白经镍柱亲和层析后得到单一的蛋白条带，目的蛋白浓度达到90%以上，说明使用该方法可以很好地纯化目的蛋白。

图5 诱导温度对重组菌表达的影响Fig.5 Effect of induction temperature on the expression of recombinant strains

图6 SDS-PAGE电泳分析纯化后目的蛋白Fig.6 SDS-PAGE analysis of the purified target protein

2.4 Clostridium bolteae ATCC BAA-613 DTEase的酶活性鉴定

利用纯化后的Clostridium bolteaeATCC BAA-613 DTEase和全细胞Clostridium bolteaeATCC BAA-613 DTEase进行果糖转化实验（图7a和图7b)，果糖与D-阿洛酮糖含量均可通过高效液相色谱法进行测定，图中果糖与D-阿洛酮糖的标样保留时间分别约为14.6min和20.8min（图7c和7d)。结果表明，Clostridium bolteaeATCC BAA-613 DTEase能够催化果糖生成D-阿洛酮糖，纯化后的酶活性更高，由此证明该酶属于DTEase家族。

2.5 Clostridium bolteae ATCC BAA-613 DTEase的催化效率研究

反应条件为45℃，pH7.0，在20%（w/v)的D-果糖反应体系中，反应10h产物含量达到最大，转化率为20%（图8)，10h后产量略有下降，这与产物的抑制作用有关。目前，国外已经报道过的DTEase家族中的成员Agrobacterium tumefaciensDPEase[9-10]、Pseudomonas cichoriiDTEase[6-8]、Rhodobacter sphaeroidesDTEase[11-12]和Clostridium cellulolyticumDTEase[13]异构化果糖的效率分别为32%、20%、17%和30%。

通过Clostridium bolteaeATCC BAA-613 DTEase催化果糖生产D-阿洛酮糖，表明该新型酶具备工业化生产D-阿洛酮糖的潜能。

3 结论

图7ClostridiumbolteaeATCCBAA-613DTEase的生物活性鉴定Fig.7 Bioactivity analysis of Clostridium bolteae ATCC BAA-613 DTEase

本研究以Clostridium bolteaeATCC BAA-613的基因组DNA为模版，通过基因合成获得DTEase的编码基因CLOBOL_00069，将其成功转化至表达菌E.coliBL21（DE3)中获得基因工程菌。在28℃温度下，添加0.5mmol/L的IPTG，诱导5h，表达产物达到最大量。经亲和层析纯化的蛋白酶液进行SDS-PAGE电泳分析，约在32ku处出现显著的单一蛋白条带，证明了Clostridium bolteaeATCC BAA-613 DTEase在大肠杆菌中得到了正确的表达。同时对Clostridium bolteaeDTEase的酶催化活性进行了研究，发现在45℃条件下，全细胞反应10h，D-阿洛酮糖的转化率为20%，说明在工业应用上该新型酶具备生产D-阿洛酮糖的潜能。

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Study on expression，purification and enzyme activity of Clostridium bolteae ATCC BAA-613 D-tagatose 3-epimerase

CHU Fei-fei1，MU Wan-meng1，XING Qing-chao1，ZHOU Liu-ming2，ZHANG Tao1，JIANG Bo1，*
（1.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China;2.Roquette America，Keokuk 52632，United States)

D-tagatose 3-epimerase is the most effective enzyme for the biological production of D-psicose from D-fructose，a novel functional factor.Gene CLOBOL_00069 encoding the D-tagatose 3-epimerase fromClostridium bolteaeATCC BAA-613 was cloned and expressed inEscherichia coli.E.coliBL21（DE3)were host cells with pUC57 as cloning vector and pET-22b（+)as plasmid to construct recombinant strains.The bacterium was induced by IPTG;then the recombinant DTEase was purified to electrophoretical homogeneity with affinity chromatography.The recombinant DTEase was analyzed by SDS-PAGE，and approximately 32ku exogenous protein was observed on the SDS-PAGE.The activity of recombinant DTEase was also studied，indicating thatClostridium bolteaeATCC BAA-613 DTEase belonged to DTEase family enzymes and had a high rate of biological transformation.The conversion reached 20%after 10h reaction.

D-tagatose 3-epimerase;D-psicose;gene recombinant;affinity chromatography

Q786

A

1002-0306（2012)07-0198-05

2011－06－20 *通讯联系人

储菲菲（1986-)，女，硕士研究生，研究方向：食品生物技术。

国家自然基金项目（20906040);中央高校基本科研业务费专项资金（JUSRP31002);江苏省社会发展科技支撑项目（BE2010626)。