百色市献血者中人类疱疹病毒8型病毒DNA的PCR检测①

赵丽娟,陈源红,周正东,李晓华,黄干荣,覃艳春,曾怡②

(1.右江民族医学院微生物学与免疫学教研室,广西 百色 533000 E-mail:zhaolijuanxk@163.com;2.广西百色市中心血站,广西 百色 533000)

人类疱疹病毒8型(human hepersvirus 8,HHV-8),又称为卡波济肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi's sarcoma-associated hepersvirus,KSHV)。根据其 137kb的双链 DNA特异性编码序列,类属于γ-2型人类疱疹病毒,于1994年由美国哥伦比亚大学病理学家张远首次发现。该病毒感染与卡波济肉瘤(Kaposi's sarcoma,KS),原发性渗出性淋巴瘤(primary effusion lymphoma,PEL),多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM),以及某些多中心卡斯特曼病(multicentric Castleman's disease,MCD)等多种肿瘤的发生有关,尤与各种KS的发生密切相关[1]。本研究应用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)方法检测了百色市献血人群中的HHV-8感染状况,探讨本市HHV-8感染率及由此发生艾滋病相关的卡波济肉瘤的可能风险。

1 材料与方法

1.1 标本来源 2009年3月～2010年12月百色市部分无偿献血者肘静脉抗凝血679份,其中男性 356份,女性323份,均置-80°C冰箱保存。

1.2 试剂与仪器 PCR引物(由上海捷倍思生物工程公司合成)序列:Primer15′-TGG CGC TCC TAA TCC TAT G-3′,Primer25′-CAT CGG TCA GTT CTG TGG TG-3′;100bp ladder plus DNA标准分子量 Marker、PCR所用试剂 Taq DNA多聚酶及缓冲液、dNTP购自Fermentas公司;1-15PK冷冻离心机(德国Sigma),Mycycler PCR仪(美国Bio-Rad),Chemidoc XRS型凝胶成像系统(美国Bio-Rad)。

1.3 方法 取1ml冻存的抗凝血样,室温水浴解冻,转移至离心管,加入等体积磷酸盐缓冲液(PBS),室温 3500g离心15min,吸去上清。将沉淀重悬于 750μ l裂解缓冲液(10mmol/L Tris-Cl pH8.0,0.1mol/L EDTA pH8.0,0.5%SDS,20μ g/mg无DNase的胰 RNase),37℃温育1h;加蛋白酶K(20mg/ml)至终浓度100μ g/ml,50℃水浴 3h;用0.1mol/L Tris-Cl(pH8.0)平衡苯酚抽提3次;加入0.2倍体积的10mol/L醋酸钠及2倍体积无水乙醇沉淀 DNA,5000g离心5min,去上清;用70%乙醇洗涤 DNA沉淀,5000g离心 5min,重复 1次,彻底去除残余乙醇;加入500μ l TE(pH8.0)溶解DNA。取5μ l DNA溶液做模板,PCR检测血液标本中的HHV-8 DNA,PCR反应体系包括:引物 Primer110pmol;引物 Primer210pmol;10× Taq DNA聚合酶缓冲液 5μ l;MgCl 2.5mmol/L;dNTPs每种 2.5mmol/L;Taq DNA聚合酶 2单位;总反应体积 50μ l。……