变异链球菌乳酸脱氢酶与霍乱毒素B亚单位嵌合表达质粒的构建和表达

张 燕，刘建国，陈 筑，马欣荣，唐 琳，吴家媛，张 剑，管晓燕

(1.遵义医学院附属口腔医院，贵州遵义 563003;2.中国科学院成都分院生物研究所，四川成都6100413.滨州医学院附属医院口腔内科，山东滨州 256603)

变异链球菌(简称变链菌)是公认的主要致龋菌。变链菌利用乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase，LDH)发酵碳水化合物产生酸性代谢物，导致生物膜环境pH值降低，是龋病发生的直接原因［1－2］。本研究采用分子生物学技术，将 LDH 编码基因ldh和免疫佐剂霍乱毒素B亚单位(CTB)编码基因ctxB克隆到原核表达载体pET32a(+)上，并诱导表达融合蛋白，为下一步构建含该嵌合基因的植物真核表达载体奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

变链菌临床分离株(血清型C，四川大学口腔疾病研究国家重点实验室龋病研究室刘天佳教授惠赠);E.coli JM109(四川大学生命学院张义正教授惠赠);pET32a(+)(四川大学生命学院张仁怀博士惠赠);pBSK－ctxB(中国科学院上海生物化学研究所吴祥甫教授惠赠);E.coli BL21(Promega公司);细菌基因组DNA提取试剂盒、小量质粒提取试剂盒、PCR纯化试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒(V－gene公司);DNA连接试剂盒、限制性内切酶KpnⅠ、SacⅠ、XhoⅠ(TaKaRa生命技术工程公司)。

1.2 方法

1.2.1 变链菌培养和基因组DNA的提取

37℃微需氧培养变链菌至饱和状态，以细菌基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA。

1.2.2 LDH 编码基因 ldh的获得

以基因组DNA为模板，根据GS－5全序列(GeneBank accession number M72545)设计引物扩增ldh。引物序列:p1:5'－GCG GGT ACC ATG ACT GCA ACT AAA CAA CA－3';p2:5'－GCA GAG CTC GGA TCC GCC GTT ACG AGC TGC AGC AAA T－3'。PCR反应体系:ddH2O 37.8 μL，10 × buffer 5 μL，dNTPs 4 μL，p11 μL，p21 μL，rTaq 0.2 μL，模板1 μL。共计50 μL。反应条件为:94℃预变性5 min，94℃变性30 s，58℃退火45 s;72℃延伸2 min;以上条件反应循环35次，72℃延伸7 min;4℃保存。5 μL PCR扩增产物进行10 g/L琼脂糖凝胶检测。使用PCR产物回收试剂盒回收全部产物。

1.2.3 质粒 pET－LDH 的构建