抗HCCR单克隆抗体的制备及其鉴定

郝 波,林 艳,张国新,施瑞华

(南京医科大学第一附属医院消化实验室,江苏南京,210029)

人宫颈癌癌基因(HCCR)是由韩国学者Ko等[1]运用差异显示RT-PCR方法从宫颈癌组织和宫颈癌细胞株中筛选出的一种癌基因。该基因定位于人染色体12q,按照分子特性不同该基因可分为HCCR-1和HCCR-2两种亚型,HCCR2缺乏HCCR1中的外显子1。其相应的蛋白为选择剪接变构体,其中HCCR1编码360个氨基酸的多肽,分子量为42 kDa;HCCR2编码304个氨基酸,分子量为36 kDa[2]。研究报道[3]尽管HCCR发现于人宫颈癌,但在宫颈癌患者血清中未见升高,在肝癌患者血清中却异常升高。本研究利用HCCR重组蛋白免疫BALB/c小鼠,制备抗人HCCR单克隆抗体(mAb),并进行相关鉴定,为进一步深入研究HCCR的生物学功能和致癌相关机制打下实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

重组pMBP-c-HCCR-His融合蛋白由本课题组制备,内含MBP和His双重标签[4]。人肝癌细胞株HepG2购自中国科学院上海细胞所,小鼠骨髓瘤SP2/0细胞系由南京医科大学卫生部抗体技术重点实验室惠赠。8周龄清洁级BALB/c雌性小鼠,由南京大学模式动物研究所提供。IPTG、HT和HAT培养基、完全/不完全弗氏佐剂、聚乙二醇、PEG4000和ImmunoType鼠mAb分型试剂盒为Sigma公司产品。蛋白A免疫亲和层析柱为Pharmacia公司产品。1640培养基购自Invitrogen公司。胎牛血清购自hyclone公司。FITC标记的羊抗鼠荧光二抗购自Inc.,Eugene。

1.2 方法

1.2.1 免疫BALB/c小鼠:①取1g纯化的HCCR融合蛋白进行10%SDS-PAGE,再电转移到PVDF膜上,切下含相应蛋白的PVDF膜,采用脾内包埋法,包埋到5只8周龄BALB/c小鼠脾内。②2周后加强免疫,将HCCR蛋白(50 g/只)与福氏不完全佐剂充分乳化,按0.2 mL/只腹腔注入BALB/c小鼠内。③2周后再次加强免疫,10 d后眼静脉放血0.2 mL,分离血清,ELISA方法检测小鼠血清中的抗体效价,Western blot方法检测其特异性。细胞融合前3 d,再次腹腔注射3×106/只,进行加强免疫。

1.2.2 杂交瘤细胞的制备和筛选:常规制备饲养细胞,接种96孔培养板,1×105个细胞/孔。取最后一次加强免疫后的小鼠脾细胞,采用PEG 4000细胞融合法,将处于生长旺盛期、外观形态良好的小鼠骨髓瘤细胞SP2/0与小鼠脾细胞按1∶5的比例进行融合。融合后的细胞以HAT培养基继续培养,5 d后用HAT培养基换出1/2培养基,10 d后以HT培养基进行选择培养。HT培养液培养1周,再换成常规含10%胎牛血清RPMI1640培养液培养,待倒置显微镜下可见大的细胞克隆形成时,用间接ELISA法检测细胞上清以筛选阳性克隆:分别用纯化蛋白MBP-HCCRHis和MBP-His进行包备,取抗体检测MBPHCCR-His(+)/MBP-His(-)的阳性孔细胞再进行两次克隆化培养,将两次检测皆为阳性的细胞立即进行克隆化培养。选取生长良好,分泌稳定的杂交瘤细胞株进行扩大培养,冻存保种。

1.2.3 抗人HCCR mAb制备和纯化:取10周龄的BALB/c小鼠,腹腔注射0.5 mL无菌液状石蜡。1周后,取生长旺盛的其中1株杂交瘤细胞,用PBS调整浓度为2×105个/mL,无菌条件下将杂交瘤细胞注入小鼠腹腔,5～10 d采集腹水离心,12000 r/min,5 min,除去细胞成分和其他沉淀物,收集上清,用间接ELISA检测纯化单抗效价。10 mL腹水加等量的结合缓冲液(1.5 mol/L甘氨酸,pH 9.0)稀释后,过 Protein ASepharoseC L-4B亲和层析柱,上样结束用结合缓冲液洗柱直到杂蛋白洗净,再用洗脱液(0.2 mol/L甘氨酸,pH3.0)洗脱,分管收集流出液,并用Tris-Cl(1 mol/L,pH 9.0)进行中和,然后测量紫外280 nm的OD值,合并蛋白质高峰管,用PBS透析。

1.2.4 抗人HCCR mAb生物学特性的分析和鉴定:①抗人HCCRmAb亚型的鉴定:取杂交瘤细胞培养上清液,用 Roch公司提供的 IsoS-tripTM鼠mAb亚类检测试剂盒进行IgG亚类鉴定。具体操作过程按照说明书进行。②抗人HCCR mAb的特异性鉴定:Western-blot法:将纯化的重组人HCCR蛋白(分别加入蛋白2.0、4.0、8.0 μ g/每孔)进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后,电转至PVDF膜上,5%脱脂奶粉封闭1 h。用抗人HCCR mAb(1∶400)4℃条件下过夜,加入羊抗鼠IgG-HRP抗体(1∶5000稀释),室温下孵育1 h,用ECL化学发光法显影。细胞免疫荧光:常规培养肝癌细胞HepG2,进行细胞爬片,丙酮固定20 min,滴加3%的H2O2溶液1滴,室温下孵育15 min。滴加抗人HCCR一抗(1∶200稀释),37℃恒温箱孵育1 h。PBS洗涤后滴加FITC标记的羊抗小鼠IgG(1∶100稀释)进行孵育30 min,荧光显微镜下观察结果。

1.2.5 间接 ELISA法的建立:以5 μ g/mL HCCR蛋白进行包被,采用间接ELISA法检测HCCR蛋白的最佳配伍HCCR抗体。

2 结 果

2.1 特异性分泌鼠抗人HCCR mAb的杂交瘤细胞株的建立

免疫BALB/c小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在HAT选择性培养基中培养融合10天后,经有限稀释法进行亚克隆和克隆后,成功筛选出2株分泌抗人HCCR mAb的杂交瘤细胞株,分别进行编号和冻存。3个月后杂交瘤细胞株经液氮冻存多次复苏传代,仍生长良好,分泌抗体性能稳定。

2.2 腹水效价的测定及抗人HCCR mAb的纯化

收取小鼠腹水,经蛋白A亲合层析纯化和透析后获得抗人HCCR mAb。用间接ELISA检测腹水和纯化单抗效价,以未免疫的小鼠血清为阴性对照,根据吸光度值/阴性对照测定值≥2.1,判定腹水中效价为1∶106,纯化单抗效价1∶105(图 1)。

图1 ELISA法测定效价

2.3 单克隆抗体性质和特异性鉴定

抗人HCCR mAb亚类鉴定:结果显示为IgG1类。Western-blot检测结果:通过Western-blot分析,在42KD位置出现特异性条带,表明纯化抗人HCCR mAb可与HCCR蛋白特异性结合,提示制备的抗人HCCR mAb具有较好的特异性(图2)。

图2 HCCR单克隆抗体Western-blot检测结果

2.4 细胞免疫荧光

结果显示肝癌HepG2细胞中胞浆和胞膜均呈阳性染色,而胞核未见染色(图3)。

图3 肝癌HepG2细胞免疫荧光染色 400倍

2.5 间接ELISA法的灵敏度

根据吸光度值/阴性对照测定值≥2.1的判定标准,通过间接ELISA方法检测不同稀释度的HCCR抗体,其检测灵敏度可达到1 μ g/L。

3 讨 论

肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,其患者死亡率高且预后差,严重威胁着人类健康。目前甲胎蛋白(AFP)检测仍是血清学诊断肝癌的主要手段,但该方法仍有一定的局限性[5-6]。因此寻找更特异、敏感的肿瘤血清学标志物和诊断方法对肝癌的诊断、疗效的判定、肿瘤的复发及患者生存期的判断具有重要意义。

目前文献报道[3]HCCR可在白血病、乳腺癌、肾癌、胃癌、结肠癌、肝癌和子宫癌等多种肿瘤中过量表达,提示HCCR在肿瘤的发生中起重要的作用,并且发现HCCR可能是肝癌、乳腺癌早期诊断的标志物[7]。进一步研究研究发现用含HCCR-1的pcDNA3质粒稳转NCI-H460和RKO细胞可使抑癌基因p53异常高表达,但与p53相关基因 p21WAF1、MDM2、Bax表达下调或失活,表明HCCR可作为P53的负性调节蛋白促进肿瘤的发生、发展[1]。Kim等[3]利用ELISA检测570例血清标本发现HCCR对肝细胞癌的诊断敏感性为78.2%,特异性为95.7%,而AFP敏感性为仅64.6%。52例AFP阴性的肝癌患者中40例HCCR显示为阳性,在直径<2 cm肝细胞癌患者的阳性率为69.2%,比AFP阳性率要高,表明HCCR可以作为肝癌敏感的诊断标志物,特别在早期肝癌及小肝癌的敏感性可能优于AFP。

作者通过本实验室自己制备的HCCR抗原免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术筛选并制备了两株能分泌高效价抗HCCR mAb,为进一步对HCCR生物学功能和高效价抗体作用机制研究奠定了基础。本研究在检测杂交细胞上清时,分别用纯化蛋白MBP-HCCR-His和MBP-His进行间接ELISA包被,成功筛选出MBP-HCCRHis(+)和MBP-His(-)细胞上清的阳性克隆孔,有效地避免MBP和His载体蛋白非特异反应的干扰,较好的增加了杂交瘤细胞的特异性。我们利用Western-blot和免疫荧光方法对HCCR mAb进行了初步验证,结果显示HCCR mAb可与HCCR蛋白特异性反应,表明本实验室制备的HCCR mAb具有较高特异性。

综上所述,本研究成功获得了2株持续稳定分泌抗人HCCR mAb的杂交瘤细胞株,为进一步深入研究HCCR的生物学功能和致癌相关机制提供了物质基础。

[1]Ko J,Lee Y H,Hwang S Y,et al.Identification and differ-ential expression of novel human cervical cancer oncogene HCCR-2 in human cancers and its involvement in p53 stabilization[J].Oncogene,2003,22:4679.

[2]Chung Y J,Kim J W.Novel oncogene HCCR:its diagnostic and therapeutic implications for cancer[J].Histol Histopathol,2005,20(3):999.

[3]Yoon S K,Lim N K,Ha S A,et al.The Human Cervical Cancer Oncogene Protein Is a Biomarker for Human Hepatocellular Carcinoma[J].Cancer Res,2004,64(15):5434.

[4]林 艳,杨 杨,张国新,等.人HCCR蛋白表达载体的构建、表达及其蛋白纯化[J].南京医科大学学报,2006,26(9):757.

[5]Colli A,Fraquelli M,Conte D.Alpha-fetoprotein and hepatocellular carcinoma[J].Am J Gastroenterol,2006,101(8):1939.

[6]Gupta S,Bent S,Kohlwes J.Test characteristics of alphafetoprotein for detecting hepatocellular carcinoma in patients with hepatitis C.A systematic review and critical analysis[J].Ann Intern Med,2008,139(1):46.

[7]Jung S S,Park H S,Lee I J,et al.The HCCR Oncoprotein as a BiomarkerforHuman Breast Cancer[J].Clin Cancer Res,2005,11(21):7700.