高糖和脂多糖对腹膜间皮细胞中骨桥蛋白的表达及其所致纤维化的影响

霍爱晶，马健飞，李程程，邓文艳，王力宁

（中国医科大学附属第一医院肾内科，沈阳 1 1 0 0 0 1）

腹膜纤维化已成为多数慢性肾衰患者退出腹膜透析的一个主要因素。腹膜间皮细胞（peritoneal mesothelial cell，PMC）在腹膜纤维化中起关键作用。当暴露在透析相关性腹膜炎环境下时，PMC的形态、结构及功能发生变化，导致其最终进入不可逆性腹膜纤维化阶段。本研究通过观察高糖透析液及炎性因子脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）单独及联合作用下骨桥蛋白（osteopontin，OPN）及纤维化因子转化生长因子 β1（transforming growth factor β1，TGF-β1）表达的变化，进一步揭示腹膜纤维化的发生及阻断机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：健康雄性SD大鼠，体质量160~200 g，普通级，由中国医科大学实验动物中心提供。

1.1.2 主要试剂：DMEM/F12干粉培养基、胎牛血清（天津灏阳）；LPS粉剂（美国Sigma公司）；0.25%胰酶（沈阳博尔美公司）；Trizol试剂（美国Invitrogen公司）；OPN多克隆抗体、DAB显色液、SABC试剂盒（武汉博士德公司）；Real-time RT-PCR试剂盒（大连TaKaRa公司）；PCR引物由北京华大基因公司合成。

1.2 方法

1.2.1 大鼠PMC（RPMC）的培养、传代与鉴定：具体方法参照文献［1］。

1.2.2 免疫组织化学法检测OPN的表达：采用24孔板培养细胞无菌爬片24 h后，无血清同步化12 h，分组并作用 24 h：（1）正常对照组：培养基中葡萄糖浓度 0.1%；（2）2.5%高糖组；（3）LPS（50 μmol/L）组；（4）2.5%高糖+LPS（50 μmol/L）联合作用组。4%多聚甲醛固定，0.5%Trix X-100打孔，3%H2O2甲醇室温孵育，灭活内源性过氧化物酶，血清封闭孵育，分别滴加1︰150稀释的OPN一抗试剂，4℃过夜（PBS代替一抗做阴性对照），滴加羊抗兔IgG孵育，DAB显色。OPN以胞质及胞核染色为阳性，选取不同视野（×100）计算单位面积阳性染色区域平均积分光密度（A）。计数OPN染色阳性细胞数占1个视野总细胞数的百分比。……