羟基喜树碱缓释片对大鼠的脑组织毒性及骨髓抑制作用研究

唐华非，刘松青，杨波，李飞，冯华

（1.第三军医大学西南医院，重庆4 0 0 0 3 8；2.解放军第3 0 5医院药局，北京 1 0 0 0 1 7）

羟基喜树碱缓释片对大鼠的脑组织毒性及骨髓抑制作用研究

唐华非1，2＊，刘松青1#，杨波1，李飞1，冯华1

（1.第三军医大学西南医院，重庆4 0 0 0 3 8；2.解放军第3 0 5医院药局，北京 1 0 0 0 1 7）

目的：研究羟基喜树碱（HCPT）缓释片对大鼠的脑组织毒性及骨髓抑制作用。方法：将大鼠随机分为正常对照组、假手术组和低、中、高剂量（HCPT∶聚乳酸（PLA）分别为1∶1 0、1∶5、1∶1）HCPT组，每组1 2只，HCPT组脑内植入相应规格的HCPT缓释片1片，假手术组行假手术模拟机械损伤。术后3 0 d分别采用苏木精-伊红（HE）染色观察各组大鼠脑组织病理变化；尼氏染色观察神经元活性；原位末端标记试剂盒（TUNEL）染色观察神经元凋亡情况；瑞氏染色观察骨髓抑制情况。结果：与正常对照组比较，其余各组大鼠脑组织均有不同程度的损伤，受损部位均出现胶质细胞增生，神经元凋亡明显（P＜0.0 1），但均未见发生骨髓抑制。与假手术组比较，中、高剂量HCPT组脑组织受损部位出现纤维化及坏死现象，神经元活性降低，神经元凋亡明显（P均＜0.0 1），低剂量HCPT组上述指标均无明显变化。结论：脑内植入HCPT缓释片对大鼠脑组织具有一定程度的毒性，但未引起骨髓抑制。

羟基喜树碱缓释片；大鼠；脑组织；骨髓抑制；神经元

近年来，间质化疗在脑胶质瘤治疗领域引起了广泛关注[1]，即将化疗药物包裹在可生物降解的多聚体材料内，通过药物扩散和聚合物骨架的降解作用控制药物释放速度[2]，局部植入治疗，不仅可使化疗药物避开血脑屏障，而且使药物直接作用于脑肿瘤组织，减少了对全身正常组织的毒性作用。局部缓控释药物间质化疗的研究，开辟了肿瘤治疗的新途径。脑植入剂是脑部间质化疗的一种新型制剂，临床研究证实[1]，该方法可显著提高肿瘤患者的生存期而不增加药物毒性作用。

本课题组前期采用聚乳酸（Polylactic acid，PLA）为缓释材料，研制了羟基喜树碱（Hydroxycamptothecin，HCPT）缓释片[3]，并对其治疗大鼠实验脑胶质瘤的疗效进行了研究，显示HCPT缓释片脑内植入治疗能明显延长荷瘤大鼠的生存期[4]。本文通过体内实验研究，旨在考察HCPT缓释片对脑组织的损伤程度及骨髓抑制作用，以综合评价HCPT缓释片的毒性。

1 仪器与材料

1.1 仪器

TP1 4 0 0实验型单冲压片机（上海沃迪机械有限公司）；石蜡包埋仪、石蜡切片机（德国Leica公司）。

1.2 试药

HCPT原料药（四川广瀚生物技术有限公司，批号：0 6 0 9 0 1，纯度：≥9 8%）；PLA（山东省医疗器械研究所，批号：0 6 0 5 0 1）；HCPT缓释片（第三军医大学西南医院药学部自制，直径：3 mm，厚度：2 mm）；多聚甲醛、tritonX-1 0 0（美国Sigma公司）；戊巴比妥钠（上海过望化工有限公司，批号：8 0-0 6-0 3）；苏木素-伊红（HE）染液、尼氏（Nissl）染液（上海Beyotime公司）；原位末端标记试剂盒（TUNEL，德国Roche公司）；瑞氏（Wright’s）染液（南京建成生物工程研究所）。

1.3 动物

成年SD大鼠，♂，体重2 0 0～2 3 0 g，由第三军医大学实验动物中心提供，生产合格证号：SCXK（军）2 0 0 2-0 0 7。

2 方法

2.1 HCPT缓释片的制备[3]

按不同质量比分别称取HCPT和PLA适量，混匀，过8 0目筛，用单冲压片机压制成片剂，60Co照射灭菌后备用。

2.2 分组与给药

将6 0只大鼠随机均分为正常对照组、假手术组和低、中、高剂量HCPT组（HCPT∶PLA分别为1∶1 0、1∶5、1∶1），如实验过程中大鼠死亡，需重新补充，以保证每组1 2只大鼠。各剂量HCPT组大鼠采用3%戊巴比妥钠4 0 mg·kg－1腹腔注射进行麻醉，立体定向仪固定大鼠头部，无菌开颅，冠状缝前3 mm、矢状缝右侧3.5 mm为中心，开直径为3 mm的骨窗[5]，切开硬膜，取60Co照射灭菌的HCPT缓释片植入脑皮层下1 mm，缝合，肌肉注射适量青霉素。假手术组采用同样方法开颅，模拟缓释片机械损伤，剪去一定大小的皮质后，缝合，肌肉注射适量青霉素。正常对照组不作任何处理。

2.3 一般情况观察

术后进行大鼠体征、体重变化以及生存期观察。以3 0 d为一个周期。

2.4 标本取材与检测

术后3 0 d，分别取每组大鼠6只，麻醉，4%多聚甲醛全身灌注，取大脑，去除缓释片残片，生理盐水冲洗，滤纸吸干水分，1 0%福尔马林溶液固定保存。各组大鼠大脑分别进行HE染色观察脑组织病理学变化；尼氏染色观察神经元尼氏体受染情况（在生理情况下，尼氏体大且数量多，反映神经元活性强；在神经元受损时，尼氏体数量减少甚至消失）；TUNEL染色观察神经元凋亡情况（棕色为凋亡阳性细胞，蓝色为被苏木素染色的细胞核；在×2 0 0镜下随机选取1 0个视野，对凋亡阳性细胞进行计数，统计大脑皮层神经元的凋亡率）。另取每组剩余6只大鼠的股骨骨髓，涂片后进行瑞氏染色，光镜下观察骨髓粒细胞、红细胞比例，判断是否发生骨髓抑制：成熟红细胞呈桔红色；中性粒细胞呈蓝紫色至紫红色；嗜酸性粒细胞呈鲜红至桔红；嗜碱性粒细胞呈深蓝色；淋巴细胞核呈深蓝紫色，其胞质呈天蓝色；单核细胞核呈浅紫色，其胞质呈灰蓝色。

2.5 统计学分析

所有数据采用x ±s表示，采用随机区组的方差分析进行数据统计整理，应用SPSS 1 3.0软件进行处理。P＜0.0 5表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 一般情况观察结果

术后4 h，大鼠均出现竖毛现象，呼吸幅度加深，活动量减少，运动迟缓，警觉性降低，口、鼻、眼分泌物增多；与假手术组比较，HCPT组大鼠偶见躯体抽搐。术后1 d，大鼠均能正常饮食，以上症状有所缓解。术后3 d，与正常对照组比较，手术后大鼠体重均有所下降。术后5 d，大鼠运动、饮食等行为与正常对照组差异不明显，行为能力测试结果差异不显著。实验期间各组大鼠均未发生非处死性死亡。

3.2 脑组织病理学变化

与正常对照组相比，其余各组大鼠脑组织均有不同程度的损伤，受损部位均出现胶质细胞增生。与假手术组比较，低剂量HCPT组脑组织的损伤未见明显病理学变化，而中、高剂量HCPT组脑组织的损伤可见明显病理学变化，受损部位出现纤维化及坏死现象。各组大鼠脑组织病理学变化见图1。

图1 各组大鼠脑组织病理学变化图（HE，×10 0）A.正常对照组；B.假手术组；C.低剂量HCPT组；D.中剂量HCPT组；E.高剂量HCPT组Tab 1 Pathological changes of cerebral tissue in of rats each group（HE，×10 0）A.normal control group；B.sham-operation group；C.HCPT low-dose group；D.HCPT medium-dose group；E.HCPT high-dose group

3.3 神经元活性情况

与假手术组比较，低剂量HCPT组术后大脑皮层神经元数量、形态和活性在组织结构上差异不显著；中剂量HCPT组神经元数量有一定的减少，胞体内尼氏体的数量有所减少，说明神经元的活性降低；高剂量HCPT组神经元数量明显减少，胞体内尼氏体大量减少，说明神经元活性明显降低。各组大鼠脑组织神经元活性情况见图2。

图2 各组大鼠脑组织神经元活性情况（Nissl，×40 0）A.正常对照组；B.假手术组；C.低剂量HCPT组；D.中剂量HCPT组；E.高剂量HCPT组Fig 2 Activity of neuron in cerebral tissue of rats in each grou（pNissl，×40 0）A.normal control group；B.sham-operation group；C.HCPT low-dose group；D.HCPT medium-dose group；E.HCPT high-dose group

3.4 神经元凋亡情况

与正常对照组比较，其余各组大鼠神经元凋亡率均明显增加（P＜0.0 1）。与假手术组比较，低剂量HCPT组神经元凋亡率无明显变化（P＞0.0 5），中、高剂量HCPT组神经元凋亡率明显增加（P＜0.0 1）。各组大鼠神经元凋亡率比较见表1。

表1 各组大鼠神经元凋亡率比较（x ±s，n＝10）Fig 1 Comparison of neuronal apoptosis of rats in each grou（px ±s，n＝10）

3.5 骨髓抑制作用

与正常对照组比较，各剂量HCPT组骨髓粒细胞和红细胞比例均无明显变化，表明未发生骨髓抑制。各组大鼠股骨骨髓抑制情况见图3（成熟红细胞为结红色；中性粒细胞颜色最深，数量较多；嗜酸性粒细胞体积是成熟红细胞2倍，数量较少；嗜碱性粒细胞核形状不规则，数量较少）。

图3 各组大鼠股骨骨髓抑制情况（瑞氏染色，×40 0）A.正常对照组；B.低剂量HCPT组；C.中剂量HCPT组；D.高剂量HCPT组Fig 3 Femoral bone marrow suppression of rats in each group（Wright’s staining，×40 0）A.normal control group；B.HCPT low-dose group；C.HCPT mediumdose group；D.HCPT high-dose group

4 讨论

PLA作为脑植入载体，对体外培养的大脑皮层神经元抑制作用和诱导凋亡作用不显著，对脑内神经组织无明显毒性[6]，故本实验未设立空白片组。

3个剂量HCPT组缓释片植入脑内后，对植入部位脑组织均具有一定的损伤，受损程度均高于假手术组，损伤部位出现了大量胶质细胞增生，中剂量HCPT组和高剂量HCPT组甚至出现局部脑组织坏死。与正常对照组比较，低剂量和中剂量HCPT组中，手术对侧脑组织未见病理学改变，神经元的数量和功能未出现显著变化；高剂量HCPT组手术对侧脑组织也仅出现了轻微的噬神经现象和轻度脑水肿现象。其原因除药物因素所致损伤外，可能还与缓释片骨架材料PLA代谢过程中产生的部分碎片有关[7]。

经实验观察，中剂量HCPT缓释片植入脑内后，致脑组织和神经细胞的损伤程度更接近于高剂量HCPT组。这是由于缓释片中的药物并非瞬间释放，而是一个缓慢释放的过程，此过程中脑组织中的药物浓度保持相对稳定的状态。Storm等[8]认为缓释片是在药物与脑组织接触的界面达到最大浓度，引起细胞毒性。所以当药物剂量达到一定值时，缓释片对脑组织毒性增大的程度变得缓慢。

本研究初步证实本课题组研制的HCPT缓释片未出现骨髓抑制，可能与血脑屏障有关；对脑组织有一定的毒性，且随HCPT剂量的增加，毒性增大。可进一步对HCPT缓释片进行优化，以期在实现治疗效果的同时，最大程度地降低毒性。

[1] Inoue T，Yamashita Y，Nishihara M，et al.Therapeutic efficacy of a polymeric micellar doxorubicin infused by convection-enhanced delivery againstintracranial9 L brain tumor models[J].Neuro Oncol，2 0 0 9，1 1（2）：1 5 1.

[2] Hong MH，Zhu SJ，Jiang YY，et al.Efficient tumor targeting of hydroxycamptothecin loaded PEGylated niosomes modified with transferrin[J].J Control Release，2 0 0 9，1 3 3（2）：9 6.

[3] 胡 婧，刘松青.HCPT缓释片的制备以及处方优化研究[J].中国药房，2 0 0 9，2 0（2 2）：1 7 3 1.

[4] 胡 婧，刘松青.羟基喜树碱缓释片瘤内植入对C6脑胶质瘤模型大鼠的肿瘤抑制作用研究[J].中国药房，2 0 1 1，2 2（9）：8 1 8.

[5] Darice YW，Scott JH，Paul HK，et al.Poly（e-caprolactone）and poly（L-lactic-co-glycolic acid）degradable polymer sponges attenuate astrocyte response and lesion growth in acute traumatic brain injury[J].Tissue Engineering，2 0 0 7，1 3（1 0）：2 5 1 5.

[6] 唐华非，刘松青，李 飞，等.聚乳酸作为脑植入剂载体的安全性初步研究[J].中国药房，2 0 1 0，2 1（1 3）：1 1 6 5.

[7] Suganuma J，Alexander HD.Biological response of intramedullary bone to poly-L-lactic acid[J].J Appl Biomater，1 9 9 3，4（1）：1 3.

[8] Storm PB，Moriarity JL，Tyler B，et al.Polymer delivery of camptothecin against 9 L gliosarcoma：release，distribution，and efficacy[J].J Neuro Oncol，2 0 0 2，5 6（3）：2 0 9.

Study on the Effects of HCPT Sustained-release Tablets on Cerebral Tissue Toxicity and Bone Marrow Suppression of Rats

TANG Hua-fei，LIU Song-qing，YANG Bo，LI Fei，FENG Hua（Southwest Hospital，The Third Military Medical University，Chongqing 4 0 0 0 3 8，China）
TANG Hua-fei（Dept.of Pharmacy，No.3 0 5Hospital of PLA，Beijing 1 0 0 0 1 7，China）

OBJECTIVE：To study the brain tissue toxicity and bone marrow suppression of HCPT sustained-release tablets in rats.METHODS：Rats were divided into normal control group，sham-operation group，HCPT low-dose（HCPT∶PLA＝1∶1 0），medium-dose（HCPT∶PLA＝1∶5）and high-dose（HCPT∶PLA＝1∶1）groups with 1 2rats in each group.Different specifications of a HCPT sustained-release tablet were implanted into rat brain of HCPT groups.Stimulated mechanical injury was induced in sham-operation group.Animal specimens were collected 3 0days after operation.HE staining was used to observe the pathological changes of cerebral tissue，Nissl staining for observation of the activity of neuron，and TUNEL for observation of apoptosis of neuron.The myelosuppression were observed with Wright’s staining.RESULTS：Compared with normal control group，different degree of cerebral injury had been observed in other groups，the colloid cells of injured site proliferated，and obvious cell apoptosis was found（P＜0.0 1），but no myelosuppression appeared.Compared with sham-operation group，the injured site of cerebral tissue in HCPT medium-dose and high-dose groups appeared fibration，necrosis，decreased of neuronal activity and significant neuronal apoptosis（all P＜0.0 1），while the brain tissue of HCPT low-dose group had no pathological changes.CONCLUSION：The brain tissue has a certain degree of toxicity after the tablets implanted into animals.But bone marrow suppression doesn’t appear.

HCPT sustained-release tablets；Rats；Cerebral tissue；Bone marrow suppression；Neurons

R9 6 5；R9 7 9.1；R9 4 4.9

A

1 0 0 1-0 4 0 8（2 0 1 2）2 9-2 7 1 0-0 3

DOI1 0.6 0 3 9/j.issn.1 0 0 1-0 4 0 8.2 0 1 2.2 9.0 8

2 0 1 1-0 8-0 5

2 0 1 2-0 5-1 8）