二、三线抗结核药体外相互作用研究

赵伟杰（北京市结核病胸部肿瘤研究所/首都医科大学附属北京胸科医院，北京 1 0 1 1 4 9）

二、三线抗结核药体外相互作用研究

赵伟杰＊（北京市结核病胸部肿瘤研究所/首都医科大学附属北京胸科医院，北京 1 0 1 1 4 9）

目的：研究1 0种二、三线抗结核药两两联用对结核分枝杆菌标准株H3 7 Rv的体外相互作用，为临床耐多药结核的治疗提供参考。方法：采用微孔板阿尔玛蓝指示剂法测定不同浓度莫西沙星（MFX）、左氧氟沙星（LFX）、克拉霉素（CLR）、对氨基水杨酸（PAS）、阿米卡星（AK）、丙硫异烟胺（PTO）、卷曲霉素（CPM）、氯法齐明（CFZ）、对氨基水杨酸异烟肼（PI）、阿莫西林/克拉维酸（AC）共1 0种二、三线抗结核药单独及两两联用对H3 7 Rv标准株的最低抑菌浓度（MIC），计算分级抑菌浓度（FIC）比以评价各药间的相互作用。结果：FIC值在0.2 5～0.5之间的有1 4种药物组合，属协同作用；FIC值在0.5 6 2 5～0.7 5的有1 8种药物组合，属部分协同作用；FIC值在0.7 6～1的有1种药物组合，属相加作用；FIC值在1～4的有7种药物组合，属无关作用。结论：二、三线抗结核药并不是都适合两两联用，应根据具体情况制订治疗方案。

抗结核药；相互作用；分级抑菌浓度比；两两联用

结核病是长期危害人类健康的慢性传染病，耐多药结核（MDR-TB，即至少同时对利福平和异烟肼耐药的菌株）是结核病的严重类型，其病程迁延、治疗效果差、治愈率低。据世界卫生组织（WHO）估算，全球每年MDR-TB的发病人数约3 0～6 0万，实际MDR-TB患者可能接近1 0 0万[1]，而中国的MDRTB患者占全球的1/4～1/3[2]，MDR-TB已经成为全球结核病控制面临的严峻挑战。但3 0多年来，尚未出现一种全新结构和作用机制的抗结核药，而二、三线药较低的治疗效果和较高的副作用又是不争的事实。因此，在现有的条件下，有必要探求二、三线抗结核药在MDR-TB治疗方案中的合理联用，以提高疗效、降低毒性。本文研究了1 0种国内常用的二、三线抗结核药两两联用对结核分枝杆菌标准株H3 7 Rv的体外相互作用，为临床MDR-TB的治疗提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

CO2培养箱（美国Thermo公司）。

1.2 试药

莫西沙星（MFX，注射剂，德国拜耳公司，批号：BXCE0 G3，规格：0.4 g·2 5 0 mL－1）；左氧氟沙星（LFX，标准品，批号：0 0 0 1 4 2 5 5 0 7，纯度：≥9 8%）、丙硫异烟胺（PTO，标准品，批号：1 2 7 K1 3 2 4）、卷曲霉素（CPM，标准品，批号：0 1 8 K1 0 6 8）购自美国Sigma公司；克拉霉素（CLR，原料药，浙江华义医药有限公司，批号：2 0 1 0 0 4 0 1 8 9，纯度：≥9 7%）；对氨基水杨酸（PAS，注射用粉末，哈药集团制药总厂，批号：B1 0 0 1 0 0 8 1 7，规格：每支2 g）；阿米卡星（AK，注射剂，上海旭东海普药业有限公司，批号：0 9 0 2 1 0，规格：0.2 g·2 mL－1）；对氨基水杨酸异烟肼（PI，原料药，重庆华邦制药有限公司，批号：2 0 0 5 0 3 1 9，纯度：≥9 7%）；阿莫西林/克拉维酸（AC，注射用粉末，华北制药有限公司，批号：F0 9 1 0 1 0 2，规格：每支1.2g）；氯法齐明（CFZ，原料药，南京立业制药有限公司，批号：1 0 0 3 0 8 1，纯度：≥9 8%）；7 H9培养基（美国Difico公司）；白蛋白-葡萄糖-过氧化氢酶（ADC，西班牙Becton Dickinson S.A.公司）；阿尔玛蓝试剂（英国Setotec公司）；吐温8 0为化学纯。

1.3 菌株

H3 7 Rv标准株（ATCC 2 7 2 9 4），由国家参比实验室提供（购自美国模式培养物集存库），北京市结核病胸部肿瘤研究所药物研究室保存。

2 方法

2.1 溶液的制备

LFX、CLR、PTO、CFZ以二甲基亚砜（DMSO）分别溶解制成浓度为1.0、3.2、1.0、1.9 2 mg·mL－1的初溶液；CPM、PI以灭菌蒸馏水分别溶解制成浓度为2 5.6、2.0 mg·mL－1的初溶液，用0.2 2 μm膜过滤灭菌；PAS、AC以灭菌蒸馏水分别制成浓度为2 0 0、1 0 0 mg·mL－1的初溶液；MFX、AK以注射剂（浓度分别为1.6、1 0 0 mg·mL－1）作为初溶液。以上各药初溶液以7 H9培养基稀释为作用浓度，具体作用浓度见表1。

表1 10种抗结核药的作用浓度Tab 1 The effect concentrations of 10anti-tuberculosis drugs

2.2 菌株的培养与混悬液的制备

H3 7 Rv标准株接种于7 H9培养基（含0.0 5%吐温8 0，1 0%ADC）中，接种浓度为1 04cfu·mL－1，置于3 7℃、5%CO2培养箱中培养1～2周，至浊度为McFarland 1（麦氏比浊管1，相当于1 07cfu·mL－1）时，以新鲜的7 H9培养基（含1 0%ADC）稀释为1 06cfu·mL－1的菌悬液。

2.3 药物单用试验

检测1 0种抗结核药单用对H3 7 Rv菌悬液的最低抑菌浓度（MIC），并设不含药物的菌液生长对照孔和不含药物与菌液的空白对照孔。方法如下：9 6孔无菌微孔板加入含各药4种浓度的培养基1 0 0 μL（生长对照孔加入1 0 0 μL不含药的培养基，空白对照孔加入2 0 0 μL不含药的培养基），加入1 0 0 μL“2.2”项下制备的H3 7 Rv菌悬液（菌的终浓度为5×1 05cfu·mL－1）（空白对照孔不加菌液），置于3 7℃、5%CO2培养箱中培养6 d；第7天加入2 0 μL阿尔玛蓝试剂和5 0 μL 5%吐温8 0，3 7℃、5%CO2培养箱中培养2 4 h，记录各孔颜色。蓝色表示无生长，粉红色表示有生长，将阻止颜色改变（从蓝色变为粉红色）的最低药物浓度定义为MIC。

2.4 药物的相互作用试验

两药间的相互作用以棋盘试验法完成[3～5]，具体操作：将1 0种抗结核药可以同时使用的4个浓度均两两（2种药物分别以a、b表示）联合（依据合理用药原则，试验中排除了同类药物（LFX与MFX）之间，注射剂（PAS、AK、CPM）之间，PAS与PI之间的两两联合）加入至9 6孔无菌微孔板，每个浓度5 0 μL，然后加入1 0 0μL“2.2”项下制备的H3 7 Rv菌悬液，其余操作同“2.3”项下，检测MIC。药物联合应用数据的评价以分级抑菌浓度比（FIC）表示：FIC＝（MICa联合/MICa单独）+（MICb联合/MICb单独）。评价标准为：FIC值≤0.5为协同作用；0.5＜FIC值≤0.7 5为部分协同作用；0.7 6＜FIC值≤1为相加作用；1＜FIC值≤4为无关作用；FIC值＞4为拮抗作用。

3 结果

3.1 药物单用的MIC

1 0种抗结核药单用时对H3 7 Rv标准菌的MIC分别为：MFX 0.1 2 5μg·mL－1、LFX 0.5μg·mL－1、CLR 4.0μg·mL－1、PAS 0.2 5μg·mL－1、AK 1.0μg·mL－1、PTO 2.0μg·mL－1、CFZ 0.2 4μg·mL－1、CPM 2μg·mL－1、PI 0.1μg·mL－1、AC 1 6μg·mL－1。

3.2 药物联用的MIC

结果显示，FIC值在0.2 5～0.5之间的有1 4种药物组合，属协同作用；FIC值在0.5 6 2 5～0.7 5的有1 8种药物组合，属部分协同作用；FIC值在0.7 6～1的有1种药物组合，属相加作用；FIC值在1～4的有7种药物组合，属无关作用。1 0种抗结核药物两两联用对H3 7 Rv标准菌的抑菌作用见表2。

表2 10种抗结核药两两联用对H37Rv标准菌的抑菌作用Tab 2 Inhibitory effect of two-drug therapy of 10 anti-tuberculosis drugs against H37Rv

4 讨论

结核分枝杆菌的药敏试验一般需要3～4周，本试验运用阿尔玛蓝指示剂（通常用于指示细胞的生长或存活）法[6]，仅需1周左右即可出结果，且具有高通量、准确、经济等特点。运用传统的试管二倍稀释法，完成1 0种药物的两两联合的相互作用试验，工作量极大；而采用结核菌快速培养仪（BACTEC）检测，不但仪器昂贵，且测试费用亦远高于阿尔玛蓝指示剂法。

MDR-TB治疗中，有关二、三线抗结核药对结核分支杆菌的相互作用还未见文献报道。因国内没有MDR-TB标准株，所以笔者测定了国内常用的1 0种二、三线抗结核药对H3 7 Rv标准株的MIC及两两联用的FIC值，笔者将在以后的工作中补充对MDR-TB分支杆菌临床分离株的药物相互作用研究。

综上，二、三线抗结核药并不是都适合两两联用，应根据具体情况制订治疗方案。

[1] Blower SM，Chou T.Modeling the emergence of the“hot zone”：tuberculosis and the amplification dynamics of drug resistance[J].Nature Medicine，2 0 0 4，1 0（1 0）：1 1 1 1.

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[3] Kim ES，Jeong SI，Kim JH，et al.Synergistic effects of the combination of 2 0-hydroxyecdysone with ampicillin and gentamicin against methicillin-resistant Staphylococcus aureus[J].J Microbiol Biotechnol，2 0 0 9，1 9（1 2）：1 5 7 6.

[4] Choi JG，Kang OH，Lee YS，et al.In vitro activity of methyl gallate isolated from galla rhois alone and in combination with ciprofloxacin against clinical isolates of salmonella[J].J Microbiol Biotechnol，2 0 0 8，1 8（1 1）：1 8 4 8.

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[6] 陆 宇，王 斌，郑梅琴，等.应用Alamar Blue和MTT测定抗结核药物最低抑菌浓度的研究[J].中国防痨杂志，2 0 0 7，2 9（6）：4 9 9.

Study the Interactions of Second or Third Line Anti-tuberculosis Drugs in Vitro

ZHAO Wei-jie
（Beijing Tuberculosis and Thoracic Tumor Research Institute/Beijing Chest Hospital，Capital Medical University，Beijing 1 0 1 1 4 9，China）

OBJECTIVE：To study the interactions of two-drug selected from 1 0second or third line anti-tuberculosis drugs to the mycobacterium tuberculosis H3 7 Rv in vitro，and to provide reference for the treatment of multidrug-resistance tuberculosis.METHODS：Alamar blue susceptibility test was used to determinate the MICs of 1 0drugs used alone and some two-drug use to H3 7 Rv.These 1 0drugs included moxifloxacin（MFX），levofloxacin（LFX），clarithromycin（CLR），para-aminosalicylic acid（PAS），amikacin（AK），protionamide（PTO），capreomycin（CPM），clofazimine（CFZ），pasiniazid（PI）and amoxicillin/clavulanic acid（AC）.The fractional inhibitory concentration（FIC）ratio of these combinations was calculated to evaluate the interactions of those drugs.RESULTS：There were 1 4combinations whose FIC ratio between 0.2 5～0.5belonging to the synergy；1 8combinations whose FIC ratio between 0.5 6 25～0.7 5belonged to partial synergy；one combinations whose FIC ratio between 0.7 6～1belonged to additive effect；7combinations whose FIC ratio between 1～4belonged to indifference.CONCLUSION：Not all second or third line anti-tuberculosis drugs are suitable for two-drug therapy.We should formulate therapeutic scheme according to the condition.

Anti-tuberculosis drugs；Interaction；Fractional inhibitory concentration ratio；Two-drug therapy

R9 6 9.2

A

1 0 0 1-0 4 0 8（2 0 1 2）2 9-2 7 1 6-0 3

DOI1 0.6 0 3 9/j.issn.1 0 0 1-0 4 0 8.2 0 1 2.2 9.1 0

＊副研究员。研究方向：抗结核药的药效学及药动学。电话：0 1 0-8 9 5 0 9 3 5 8。E-mail：zhaoweijie0 4 1 5@yahoo.cn

2 0 1 1-0 8-1 0

2 0 1 1-1 0-1 4）

＊副主任护师。研究方向：静脉药物配置及合理用药。E-mail：hdfywxh@sina.com