苯丁酸钠对胃癌细胞株SGC-7901的增殖抑制作用

刘 奇 陈德兴 赵吉生 (吉林省前卫医院普外科，吉林 长春 3002)

苯丁酸钠对胃癌细胞株SGC-7901的增殖抑制作用

刘 奇 陈德兴 赵吉生1(吉林省前卫医院普外科，吉林 长春 130012)

目的 研究苯丁酸钠(SPB)在体外对胃癌细胞株SGC-7901生长、分化的影响。方法 应用MTT分析法、流式细胞仪、形态学观察法对在体外经不同浓度的SPB处理过的SGC-7901细胞进行检测。结果 SPB能抑制SGC-7901细胞的生长，并且有时间依赖关系及剂量依赖关系;应用流式细胞仪测定发现，经SPB处理的细胞其S期在16.48%，而未经处理的细胞其S期在31.07%;电子显微镜观察，细胞形态发生改变。结论SPB在体外抑制胃癌细胞株SGC-7901的生长，为SPB治疗胃肿瘤提供了实验依据。

苯丁酸钠;SGC-7901;生长抑制

苯丁酸钠(SPB)作为一种诱导分化剂，对多种肿瘤具有诱导分化和杀伤作用，通过抑制组蛋白脱乙酰基酶诱导肿瘤细胞分化，抑制肿瘤细胞生长，以改变染色质和基因表达。其分化作用已被证明是通过诱导G0/G1终末分化以及诱导与分化有关的细胞周期调节关键点p21WAF1而实现的。SPB在体内经β氧化转变成苯乙酸钠(PA)，后者又可与血浆中谷氨酰胺合成苯乙酰谷氨酰胺(PAG)。目前发现SPB对喉癌、视网膜母细胞瘤、白血病和淋巴瘤、黑色素瘤、肝癌、脑肿瘤均有作用，本文拟探讨SPB在体外对胃癌细胞株SGC-7901生长、分化的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

细胞培养人胃癌细胞株SGC-7901，购自上海生物制品研究所。培养于含20%小牛血清(FCS)(杭州四季青生物工程材料研究所)的RPMI 1640培养基中，培养箱37℃，每3～4 d传代一次，每24 h换液一次。SPB分子式C10H11O2Na，分子量186.2，本品为无色无味固体，RPMI1640培养液配制成储存液，－20℃保存。本品自晶美生物有限公司。MTT购于华美生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 MTT法测定SPB对SGC-7901细胞的抑制率 将5×104/ml接种于96孔板中，100 μl/孔，置于二氧化碳培养箱中，常规培养过夜(细胞完全贴壁)后，加入SPB，20 μl/孔，细胞对照孔加等量无血清培养液代之。各孔补充含10%小牛血清的RPMI1640培养液，使终体积为200 μl，每组设6个复孔，另设只加培养液的空白对照组。SPB终浓度分别为0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mmol/L，0 mmol/L作为两药的阴性对照组。3 d后每孔加人20 μl MTT，于37℃的CO2培养箱中继续孵育4 h，弃上清加人150 μl二甲基亚砜(DMSO)，振荡混匀10 min，使紫蓝色沉淀充分溶解，采用全自动酶标仪在波长570 nm处测吸光值(A值)。

1.2.2 流式细胞仪分析 将浓度为1×106/ml的细胞加入6孔培养板，1 ml/孔。常规培养24 h后，向各孔内加入受试药物并置于恒温培养箱中培养72 h消化各组细胞制成单细胞悬液，1 000 r/min离心5 min;PBS洗涤2次，PBS重悬细胞;加入50 μl RNase A(10 g/L)，室温 下孵育 30 min; 加 入 500 μl 100 mg/L PI染色液(0.01 mol/L PBS溶液，4℃避光保存)，旋转混匀，置4℃避光孵育30 min;上机测试，软件分析。

1.2.3 电子显微镜观察SGC-7901细胞超微结构的变化

SGC-7901细胞在25 cm2培养瓶中传代培养，加入 SPB 4.0 mmol/L此日被视为第0天。用0.25%的胰酶消化，消化前倒置显微镜下先拍片。0.25%胰酶消化收集细胞，离心1 500 r/min。离心10 min后取离心管，底部细胞团块切成约1.5 mm3大小，经 2.5%戊二醛前固定后，乙醇系列脱水，Epon812环氧树脂包埋，LKB-Ⅲ型超薄切片机半薄切片定位后做超薄切片，醋酸双氧铀及柠檬酸铅双重染色，JEM-1200EX型透射电镜观察，摄片。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 MTT法测定SPB对SGC-7901细胞生长的抑制作用

胃癌细胞 SGC-7901 经0，0.5，1.0，2.0，4.0，8.0 mmol/L 的 SPB作用24、48、72 h的检测结果，除了4.0 mmol/L浓度的SPB作用于SGC-7901细胞48 h、72 h两者之间无统计学意义(P＞0.05)，其他各组均存在统计学意义(P＜0.05)，即随着SPB用药剂量的增加和作用时间的延长，所测得的增殖抑制率升高越明显。表明SPB对胃癌SGC-7901细胞的增殖呈时间和剂量依赖性抑制作用。见表1。

2.2 流式细胞仪测定细胞周期

4.0 mmol/L SPB作用72 h后G0/G1期明显增加，S期减少(P＜0.05)。表明SPB抑制了SGC-7901细胞分裂和DNA的合成，细胞周期出现G0/G1期阻滞。见表2。

表1 不同浓度SPB作用后的SGC-7901细胞在不同时间的抑制率(%)

表2 SPB用药作用72 h对SGC-7901细胞周期的影响(%)

2.3 电子显微镜测定SPB对SGC-7901细胞超微结构的影响

图1 电子显微镜检测SGC-7901细胞超微结构

图1可见，电子显微镜下观察对照组SGC-7901细胞呈多型性，表面有许多微绒毛，细胞结构完整，细胞核形细胞核较大，核质比明显增大;有的胃癌细胞核圆形、椭圆形或不规则形，多个细胞核，核仁明显;观察胃癌细胞局部情况发现细胞质内线粒体丰富，可见粗面内质网和游离核糖体丰富，符合胃癌细胞高增殖的特点。应用SPB 4.0 mmol/L作用72 h后SGC-7901细胞固缩，表面微绒毛消失，可见多个钝性突起，细胞核不规则，核内异染色体略增多，核基质轻度改变，糖原颗粒增多，线粒体改变;有些细胞胞质内存在较多空泡;有些细胞局部细胞呈不规则形改变，核内异染色体增多，胞质改变，空泡增多;一部分细胞呈现空化状，核圆，核基质空化，细胞质内线粒体和溶酶体肿胀。说明SPB对胃癌细胞株SGC-7901的增殖起了抑制作用。

3 讨论

SPB起初发现可治疗新生儿脑病，并可作为一种氨清除剂治疗尿素循环紊乱疾病〔1〕;近年来发现其可作为一种诱导分化剂，对多种肿瘤具有诱导分化和杀伤作用，但剂量过大对实体肿瘤无效用〔2〕。它的抗肿瘤作用机制主要表现在：(1)PPAR的激活：PPARs属于核类固醇受体超家族，是一种核内受体转录因子，有三种亚型：PPARα、PPARβ和 PPARγ。PPARs激活后可抑制 cyclinD1，cyclinB、cyclinE，CDKIP21蛋白表达，阻滞细胞分裂增殖和CDK4表达，并上调CD-KIP21和P27蛋白表达从而抑制肿瘤细胞生长〔3〕。(2)活化细胞外信号调节激酶(ERK)和促进激活蛋白-1(AP-1)转录：ERK是三种促分裂原激活蛋白激酶(MAPKs)中的一种。MAPK信号传导通路是典型的丝氨酸/苏氨酸磷酸化方式，可以激活ERK。蛋白激酶C(PKC)、ras-GTP可磷酸化激活 Raf-l激酶，后者磷酸化激活MAPK，进而将 MAPK/ERK1激酶(MEKl)和 MEK2激活。MEK1和MEK2的活化则可进一步磷酸化ERK，从而活化其下游的核内转录因子AP-1。C-jun是AP-1家族中含有亮氨酸拉链结构的转录因子，它能与自身或其他家族成员JunD、c-Fos和ATF-2形成二聚体，并与DNA结合位点结合使相关基因转录激活〔4〕。(3)抑制p21ras蛋白的异戊烯化及胆固醇的合成，由于胆固醇和异戊二烯是瘤细胞生长所必需的，因而他们合成的减少也对体内肿瘤生长起抑制作用。本文发现经不同浓度的SPB作用后的SGC-7901细胞，细胞生长抑制表现出明显的时间剂量依从性，说明SPB具有调节胃癌SGC-7901细胞的增殖和分化能力，预示在治疗胃癌肿瘤方面SPB具有良好的前景。

1 Lee B，Rhead W，Diaz GA，et al.Phase 2 comparison of a novel ammonia scavenging agent with sodium phenylbutyrate in patients with urea cycle disorders：safety，pharmacokinetics and ammonia control〔J〕.Mol Genet Metab，2010;100(3)：221-8.

2 Lin J，Gilbert J，Rudek MA，et al.A phase I dose-finding study of 5-azacytidine in combination with sodium phenylbutyrate in patients with refractory solid tumors〔J〕.J Clin Cancer Res，2009;15(19)：6241-9.

3 潘华锋，陈孝平.Ciglitazone抑制人肝癌HepG2细胞增殖活性的实验研〔J〕.中华实验外科杂志，2004;21(8)：934-6.

4 孙象军.苯丁酸钠及二甲基甲酰胺对乳腺癌细胞增殖抑制及诱导分化的实验研究〔D〕.吉林大学，2007.

R735.2

〕 A

〕 1005-9202(2012)22-4960-02;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.22.050

1 吉林大学中日联谊医院

刘 奇(1979-)，男，主治医师，主要从事肝胆外科疾病的诊治研究。

〔2012-01-10收稿 2012-02-10修回〕

(编辑 徐 杰)