β-七叶皂甙钠对肠缺血再灌注损伤后肠粘膜屏障功能、形态学变化的影响＊

延安大学医学院局解手术学教研室（延安716000） 朱文侠 王航辉 韩振奎

肠缺血再灌注损伤（Intestinal ischemia reperfusion injury，IIRI）是常见的临床围手术期难题。IIRI可引起伴通透性增加的肠上皮屏障功能障碍与细菌易位。另外，肠被认为是炎性细胞因子引起肠源性全身炎症反应综合征、败血症、多器官功能衰竭进展的根源［1，2］，因此保护肠粘膜屏障日益受到重视。肠缺血再灌注损伤后，缺氧、内毒素、酸中毒等多种因素影响肠粘膜屏障（Intestinal mucosal barrier）的结构和功能。β-七叶皂甙钠（Sodium aescinate，SA）为纯天然植物提取物，是从中药娑罗子的干燥成熟果实中提取的二萜皂甙钠盐，最大限度地保存了生物活性。研究证明［3～7］：β-七叶皂甙钠具有抑制炎症、清除自由基、抗渗出、抗水肿、抗凋亡，改善微循环等作用。本研究旨在探索β-七叶皂甙钠对大鼠肠缺血再灌注损伤早期肠粘膜屏障功能和形态学研究，进一步探讨其保护肠粘膜屏障的作用及可能机制。

材料和方法

1 实验动物及分组 成年雄性SD大鼠54只，体重为170～180g，随机分为3组：假手术组和模型组、β-七叶皂甙钠（山东烟台绿叶制药股份有限公司）治疗组。

2 方 法

2.1 制作大鼠肠缺血-再灌注损伤模型：麻醉大鼠，作腹正中切口，分离出肠系膜上动脉（Superior mesenteric artery，SMA）。假手术组只分离SMA，不结扎；模型组在SMA根部用无创伤血管夹夹闭，阻断45min后松夹，恢复血流后观察24h；治疗组同前，于缺血前30min对每只大鼠行尾静脉推注β-七叶皂甙钠（10mg／kg）。假手术组和模型组给予等量生理盐水。再灌注24h后处死动物，取回盲部10cm以上肠管，固定，包埋，4℃保存。一部分测湿／干重比值；一部分光学显微镜观察小肠组织的损伤程度。手术过程中，腹腔内滴加生理盐水5ml。

2.2 肠组织湿／干比值的测定：取小肠组织，吸干表面水分后称重量为湿重（W）；然后将组织置入70℃恒温电烤箱中反复烘烤72h至恒重，称重量为干重（D）。计算湿重与干重比值（W／D），表示组织水肿形成情况，间接反映毛细血管的通透性。

2.3 肠组织血管通透性检测：根据渗入组织中的伊文氏蓝染料量评价血管的通过性［8］。再灌注前2 min，于股静脉注射2%伊文思蓝（Evans Blue，EB）2 mg／kg，再灌结束后取回盲部10cm以上肠管约5cm剪开，37℃干燥24h，称重后用3ml甲酰胺室温浸泡24h提取伊文氏蓝。620nm处绘制伊文氏蓝的标准曲线，结果以μg／g肠组织表示。

2.4 透射电镜观察肠粘膜屏障变化：再灌注24 h后取肠组织，将回肠标本修成1mm×1mm×3 mm大小，固定，脱水、浸透、包埋、超薄切片，透射电镜观察（TOSHI-BA，Japan）。

结 果

1 肠粘膜结构的Chiu’s评分［9］评分标准见表1。光镜下假手术组肠粘膜形态结构完整（图1）；模型组肠粘膜和粘膜下层充血、水肿、糜烂，中性粒细胞浸润（图2）；治疗组亦可见上述表现，但损伤程度较模型组明显减轻（P＜0.05）（图3）。Chiu’s评分模型组的最高、假手术组最低。治疗组相对模型组明显降低（P＜0.05）（见表2）。

表1 肠粘膜损伤评分分级

表2 大鼠肠组织Chiu评分、湿／干重比值及伊文思蓝含量（n＝6，±s）

表2 大鼠肠组织Chiu评分、湿／干重比值及伊文思蓝含量（n＝6，±s）

注：模型组和β-七叶皂甙钠治疗组比较＊P＜0.05，假手术组和β-七叶皂甙钠治疗组比较＊＊P＜0.05

分组 Chiu’s评分 湿／干重比值（%）伊文思蓝含量（μg／g）4.89±0.61 103.39±10.27模型组 4.0±0.35＊＊ 6.46±0.27＊ 285.46±21.09＊β-七叶皂甙钠治疗组 2.3±0.26 5.19±0.51＊ 140.25±19.18假手术组 0±0.000＊＊

2 各组大鼠肠湿／干重比值 如表2所示。β-七叶皂甙钠能明显降低肠缺血再灌注大鼠的肠湿／干重比值，与模型组比较差异显著（P＜0.05）。

3 β-七叶皂甙钠对大鼠肠粘膜屏障通透性的影响 肠缺血再灌注后，模型组及β-七叶皂甙钠组肠组织EB含量明显高于假手术组（P＜0.05）；而β-七叶皂甙钠组肠组织EB含量较模型组明显降低（P＜0.05），提示β-七叶皂甙钠对肠粘膜屏障有较好的保护作用（表2）。

4 β-七叶皂甙钠对肠粘膜组织细胞超微结构的影响 假手术组肠粘膜形态完整，紧密连接和桥粒结构清晰，可见大量排列整齐的微绒毛（图1）。模型组肠粘膜结构紊乱，绒毛破损，紧密连接结构模糊、肿胀，微绒毛大量脱落、断裂（图2）；而β-七叶皂甙钠组肠粘膜破坏减轻，紧密连接结构大致可见，肿胀缓解（图3）。

图1 假手术组大鼠正常肠粘膜结构（H＆E×200）

图2 模型组大鼠肠粘膜结构破坏（H＆E×200）

图3 治疗组大鼠肠粘膜结构基本恢复（H＆E×200）

讨 论

肠粘膜屏障是肠道防御机制中最重要的环节，主要由机械屏障、生物屏障、免疫屏障［10，11］及化学屏障构成，其中机械屏障是肠粘膜屏障的根本。肠道机械屏障由肠粘膜表面的粘液层、肠上皮层及其密连接、上皮基底膜、粘膜下固有层等组成。广义的机械屏障还包括肠道的运动功能，肠蠕动将肠内食物残渣向远侧推进，防止细菌在邻近肠粘膜的长时间滞留，减少细菌穿过粘液层到达上皮的机会，起“肠道自洁作用”。机械屏障的结构基础是肠粘膜上皮细胞细胞与细胞之间完整的连接。肠缺血再灌注等应激状态下，其结构完整性和连续性被破坏，致使机械屏障作用减弱［12］。本实验模型组大鼠肠粘膜的光镜、电镜观察发现，肠粘膜组织结构紊乱、破坏。治疗组大鼠使用中药β-七叶皂甙钠后，光镜下组织病理、电镜下细胞超微结构的观察显示肠粘膜组织结构基本恢复正常，表明其对肠粘膜屏障组织结构有较好的保护作用。

图4 假手术组大鼠正常肠粘膜上皮细胞（TEM×6600）

图5 模型组大鼠肠粘膜上皮细胞凋亡（TEM×8900）

图6 β-七叶皂甙钠组大鼠肠粘膜结构基本恢复（TEM×8900）

肠道最主要功能是吸收营养、排出食物残渣、细菌及其产物。这些功能的维持有赖于肠粘膜的连续性与屏障结构的完整性。然而，在特定的病理状态下，如肠缺血再灌注损伤，肠失去其屏障功能可导致全身性微生物感染甚至多器官功能衰竭［13，14］。实验发现，肠缺血再灌注24h后，渗漏到血管外的EB含量和肠组织湿／干重较假手术组明显增加，与电镜观察到毛细血管周围有大片水肿，共同提示肠粘膜屏障的通透性显著增加，引起了血管源性肠水肿。此过程中肠机械屏障开放可能与肠组织的过度灌流、自由基形成有关。肠粘膜结构受损，导致其屏障功能减弱，通透性增加。使生理状态下不能通透的物质进入组织间隙，继发血管源性肠水肿，进一步加重再灌注损伤。β-七叶皂甙钠能携带长链脂肪酸进入线粒体参加β氧化，并且作为氧自由基抑制剂，能减轻氧化应激、减少脂质过氧化、抗凋亡［5，13］。应用β-七叶皂甙钠后，肠组织 EB含量和肠组织湿／干重减少，毛细血管周围的水肿也减轻，提示β-七叶皂甙钠在代谢紊乱时对肠的正常功能的维持起着重要的保护作用。

综上所述，β-七叶皂甙钠可以维护肠粘膜屏障的完整性和连续性，降低肠粘膜血管的通透性，进一步证实了β-七叶皂甙钠对肠缺血再灌注损伤所致肠粘膜屏障的形态与功能具有保护作用，为其在肠粘膜屏障损伤中的防治提供了理论依据。β-七叶皂甙钠对肠粘膜屏障保护作用的详细机制仍有待进一步研究。

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