苦参碱诱导宫颈癌Hela细胞的凋亡作用＊

西电集团医院（西安710077） 王 丽 苏宝山 吴 静

苦参碱（Mat）是从我国传统中药苦参中提取的一种生物活性成分，具有广泛的药理学作用［1］。Mat有抗心率失常，抗炎，抗病毒，调节免疫，抗变态反应等作用，现已被广泛应用于临床各科［2，3］。目前大量的体内外研究证实，Mat可明显抑制肿瘤细胞的增殖，诱导其向正常分化和凋亡，研究较多的是Mat对肝癌细胞及白血病细胞的作用，但对宫颈癌Hela细胞的研究尚少，本实验旨在研究Mat对宫颈癌Hela细胞的增殖及凋亡的影响，为Mat应用于宫颈癌的临床治疗提供实验依据。

材料和方法

1 实验材料

1.1 人宫颈癌Hela细胞株：由西安交通大学医学院癌症研究所惠赠。

1.2 主要试剂（如无特指均为国产分析纯试剂）：Mat纯度为98%，购自陕西昂盛生物医药科技有限公司；RPMI-1640培养基为美国GIBCO产品；小牛血清（BCS）杭州四季青生物工程材料研究所；MTT（四甲基偶氮唑盐）和碘化丙啶（PI）为美国Sigma公司产品。

1.3 主要仪器和设备：CO2培养箱（SHEL-LAB型，美国），超净工作台，倒置光学显微镜（OLYMPUSCK40型，日本），酶标比色仪（450型，美国Bio-Rad公司），流式细胞仪（Coulter Epics XL）。

2 方 法

2.1 细胞培养：将宫颈癌Hela细胞用含10%小牛血清（BCS），青霉素100U／ml，链霉素100ug／ml的RPMI 1640培养基，置于37℃、含5%CO2饱和湿度培养箱孵育传代培养，每天观察细胞。

2.2 显微镜下观察不同浓度Mat作用宫颈癌Hela细胞后细胞形态学的变化。

2.3 MTT法检测Mat对Hela细胞的增殖抑制影响：收集对数增殖期细胞，培养液配成单细胞悬液，计数，调整细胞密度为5×104／ml，接种于96孔培养板，每孔100μl。将Hela细胞分为Mat组及对照组分别加药。Mat组的终浓度依次为：0.5mg／ml、1.0mg／ml、1.5mg／ml、2.0mg／ml。每个浓度均设4个平行复孔，每孔总体积200μl，以不加药组为对照组（细胞悬液100μl、培养液100μl）。另设调零孔，只加培养液200μl。共同于37℃、5%CO2饱和湿度的孵箱中培养24h、48h、72h后，每孔加入 MTT（5mg／ml）20μl，继续于上述环境中培养4h后弃去上清液，加入二甲基亚砜（DMSO）各150μl，微型震荡混合仪震荡15min，使结晶物完全溶解，酶联免疫仪上选择波长490nm，以调零孔调零后，测定每孔吸光度值（OD值）。

重复以上实验3次，按下列公式计算细胞生长抑制率：

细胞生长抑制率（%）＝［1-（实验组OD490均值／对照组OD490均值）］×100%

2.4 Annexin V FITC／PI双标染色，流式细胞仪测定Hela细胞凋亡率：将不同浓度Mat作用不同时间的宫颈癌Hela细胞EDTA消化、PBS洗涤离心2次，缓冲液重悬细胞，吸取100μl细胞悬液于流式管中，加入5μl Annexin V FITC、10μl PI，混匀后避光孵育15min，在加入400μlPBS，流式细胞仪分析细胞凋亡。

结 果

1 各组细胞培养结果 苦参碱各处理组细胞培养72h后，光镜下均见贴壁细胞脱落，变圆，体积缩小，悬浮于培养液中，胞质内见较多颗粒，色深，呈深褐色；胞核颜色加深，折光性增强。而且随着苦参碱浓度增加，培养液中脱落死亡细胞数增加。对照组细胞脱落甚少，背景干净，Hela细胞呈多角形，贴壁生长良好，胞质饱满，相邻细胞生长已连接成片（见图1、图2）。

2 MTT增殖抑制实验结果 不同浓度Mat作用于Hela细胞不同时间，均能不同程度抑制其生长，并且随Mat浓度增加及培养时间延长抑制率增强，呈现时间-剂量依赖性；不同浓度组，作用不同时间 Mat对Hela细胞的抑制率在3.2%～44.8%之间，以2.0mg／mlMat作用于Hela细胞72h抑制作用最强，抑制率为44.8%，不同浓度Mat、作用不同时间，与对照组相比，统计学分析结果显示差异均有显著性﹙P＜0.05﹚。测得OD值见表1，计算所得不同浓度组抑制率见表2及图3。

图1 正常生长的Hela cells（DABx400）

图2 苦参碱作用后的Hela cells（DABx400）

图3 苦参碱抑制Hela细胞生长曲线

表1 Mat对宫颈癌HeLa细胞的增殖抑制作用（±s，n＝4）

表1 Mat对宫颈癌HeLa细胞的增殖抑制作用（±s，n＝4）

Mat（mg／ml）OD 24h 48h 72h 0.0 0.680±0.002 0.685±0.001 0.692±0.004 0.5 0.658±0.005 0.655±0.007 0.632±0.005 1.0 0.603±0.001 0.583±0.005 0.547±0.001 1.5 0.529±0.002 0.508±0.003 0.470±0.004 2.0 0.458±0.004 0.401±0.002 0.382±0.002

表2 不同浓度Mat对宫颈癌Hela细胞的抑制率

3 流式细胞仪检测Hela细胞凋亡率 Hela细胞经不同浓度苦参碱作用24、48、72h后，细胞凋亡率随苦参碱浓度增加及作用时间的延长而明显升高，各浓度组及作用时间段与对照组相比均有显著差异性﹙P＜0.05，见表3）。

表3 不同浓度Mat诱导宫颈癌HeLa细胞的凋亡率

讨 论

宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一，其发病机制复杂，至今尚不明确。对宫颈癌早期诊断、早期治疗达到了前所未有的水平。但是，对中晚期宫颈癌的综合治疗，5年存活率及生活质量仍较低。人们早已发现从中草药及天然植物中提取的活性成分有抑制肿瘤细胞的增殖，杀伤肿瘤细胞的作用，如临床上常用的抗癌药物如长春新碱、紫杉醇等都是从天然中草药中提取成分，跟踪分离筛选、结构改造与化学合成的，多年来的临床应用表明，它们的抗癌疗效显著，现已成为临床抗癌的常用药，广泛用于各种肿瘤的化疗。

苦参是传统中药之一，又名野槐、山槐、地参等，从苦参中可分离出23种生物碱，其中主要是Mat和氧化苦参碱［4］，其中Mat的药理作用广泛，随分子生物学的发展，目前对Mat抗肿瘤研究已经成为中药抗癌研究之热点，大量研究已经证明Mat有抑制肿瘤细胞增殖，诱导细胞凋亡、分化等作用，同时具有减轻放化、疗毒副作用、升高白细胞、提高机体免疫力，逆转肿瘤细胞的多药耐药（MDR），增加化疗药对肿瘤细胞的敏感性［5，6］。凋亡是由基因控制的细胞程序性死亡，属于细胞生理性死亡，通过细胞凋亡，机体能及时清除过多的、受损的或恶变细胞，维持机体内环境的稳定。人们越来越认识到凋亡与肿瘤的发生、发展和治疗密切相关。

本实验用不同浓度Mat作用于体外培养的宫颈癌Hela细胞24h、48h、72h后，显微镜下观察细胞形态，发现Hela细胞由原来的多边形，贴壁、形态饱满，连接成片变成体积缩小、变圆，脱落悬浮于培养液中，胞质、胞核颜色加深；采用MTT法测定Mat对宫颈癌Hela细胞增殖抑制作用；流式细胞仪检测Hela细胞凋亡率，结果发现不同浓度的Mat、作用不同时间对宫颈癌Hela细胞的增殖均有抑制作用，可诱导Hela细胞凋亡，说明Mat对宫颈癌Hela细胞有抑制作用，可作为中晚期宫颈癌的治疗的辅助用药。

近年来对凋亡机制研究的不断深入，使得我们利用凋亡机制治疗肿瘤成为可能。从凋亡途径机制中寻找治疗肿瘤靶点，现已有报道，能否应用于临床，还有待进一步研究。

［1］肖培根.新编中药志［M］.北京：化学工业出版社，2002，555-561.

［2］张宝恒，王年生，李学军，等.苦参碱的抗心率失常作用［J］.中国药理学报，1990，11（3）：253-257.

［3］陈小文，樊国强.苦参碱注射液治疗慢性乙型肝炎效果分析［J］.南华大学学报（医学版），2006，34（4）：132-134.

［4］马方励，程 怡.苦参碱多种制剂的药效学研究进展［J］.中成药，2004，26（5）：420-422.

［5］李旭芬，张苏展，郑 树，等.苦参碱对K562及多药耐药细胞K562／vin的细胞生物学影响［J］.中国病理生理杂志，2002，18（10）：1233.

［6］李文瑜，李舜华，崔克义，等.苦参碱逆转的白血病多药耐药细胞系K562／AO2对柔红霉素耐药性的研究［J］.中国病理生理学杂志，1998，14（5）：521.