肝脾调补方对小鼠免疫性肝损伤的防护作用*

阮连国 张 妍 朱清静△

1.武汉市医疗救治中心肝病科 (湖北武汉，430023) 2.武汉市妇女儿童医疗保健中心

肝脾调补方是我院肝病科治疗病毒性肝炎的院内制剂，临床已应用多年，其在改善患者肝功能和临床症状方面疗效确切。由党参、白芍、郁金、甘草、当归、茯苓、半夏、白术、柴胡、陈皮、鸡内金等组成。现代研究表明免疫损害机制在病毒性肝炎发病和慢性化过程中起到主要作用。我们通过动物实验观察了肝脾调补方对小鼠免疫性肝损伤的防护作用，并初步探讨其作用机制，为其临床应用提供理论依据。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 昆明种小鼠60只，雌雄各半，体重18g～22g，由华中科技大学同济医学院动物试验中心提供。

1.2 药物及试剂 肝脾调补方由党参、白芍、郁金、甘草、当归、茯苓、半夏、白术、柴胡、陈皮、鸡内金等组成，由我院中药制剂室提供，加10倍量水浸泡4小时，加热煎煮1小时，过滤，药渣再加8倍水，煎煮1小时过滤，两次滤液合并，浓缩制成浓度为1∶1(即1ml水煎剂含1g生药)的水煎剂备用。卡介苗(BCG)由上海生物制品研究所提供。脂多糖 (LPS)由美国 Sigma公司提供。ALT、AST、SOD、MDA、GSH-Px试剂盒:南京建成生物工程研究所;TNF-α酶联免疫试剂盒:由上海森雄科技实业有限公司提供，编号WZ201010;EILSA试试剂盒由武汉博士德生物公司提供;TBA240FR型全自动生化分析仪:日本东芝公司生产。

1.3 动物与分组 动物随机分为5组，即正常对照组，模型对照组，肝脾调补方高、中、低剂量组 (28、14、7g/kg)，每组12只。

1.4 造模 正常组尾静脉注射生理盐水 (0.2ml/只)，其余各组每只小鼠尾静脉注射1%BCG溶液0.2ml。次日起，正常组和模型组每日灌胃生理盐水30ml/kg，连续12天;肝脾调补方低、中、高剂量分别给予0.5、1.0、2.0g/kg剂量的药物。连续给药12天，末次给药后，正常组尾静脉注射生理盐水 (0.2ml/只)，其余各组动物均尾静脉注射LPS(4g/只)，静脉注射后禁食16小时，小鼠摘眼球取血，分离血清，以试剂盒所示方法测定血清中ALT、AST和TNF-α含量。然后处死小鼠，取肝脏，用生理盐水配10% 肝组织，用超声波细胞粉碎机匀浆，低温离心，按试剂盒说明书所述方法用Agilent8453紫外可见分光光度计测定肝匀浆中 SOD、MDA、GSH-Px的含量。

2 结果

2.1 对血清ALT、AST含量的影响 见表1。

表1 各组小鼠血清ALT、AST的影响()

表1 各组小鼠血清ALT、AST的影响()

与正常组比较，☆P＜0.01;与模型组比较:△P＜0.01，#P＞0.05

表1显示，与正常组相比较，模型组血清ALT、AST水平升高，P＜0.01，说明模型建立成功。与模型组比较，肝脾调补方高、中剂量组均能非常显著地降低小鼠血清中升高的ALT、AST水平 (P＜0.01)，低剂量组则显示无效;肝脾调补方中、高剂量组之间降低ALT水平的作用存在量效关系。

2.2 对免疫性肝损伤小鼠肝TNF-α含量的影响 见表2。

表2显示，与正常组相比较，模型组TNF-α水平升高，P＜0.01;与模型组比较，肝脾调补方高、中剂量组均能非常显著地降低小鼠TNF-α水平 (P＜0.01)，低剂量组则显示无效;肝脾调补方中、高剂量组之间降低TNF-α水平的作用存在量效关系。

2.3 对肝匀浆SOD、MDA、GSH-Px水平的影响 见表3。

表2 肝脾调补方对免疫性肝损伤小鼠TNF-α含量影响()

表2 肝脾调补方对免疫性肝损伤小鼠TNF-α含量影响()

与正常组比较，☆P＜0.01;与模型组比较:△P＜0.01，#P＞0.05

表3 肝脾调补方对免疫性肝损伤小鼠SOD、MDA、GSH-Px水平影响()

与正常组比较，☆P＜0.01;与模型组比较，△P＜0.01

表3显示，与正常组比较，模型组、肝脾调补方高、中、低剂量组肝匀浆SOD、GSH-PX水平显著降低 (P＜0.01)，MDA水平显著增高 (P＜0.01)。肝脾调补方高、中、低剂量组均能升高模型小鼠肝匀浆 SOD、GSH-Px的水平 (P＜0.01)，降低MDA的水平 (P＜0.01)。肝脾调补方高、中、低剂量组在升高小鼠肝匀浆SOD、GSH-Px水平及降低MDA方面呈一定的量效关系 (P＜0.05)。

3 讨论

免疫性肝损伤 (Immunological Liver Injury，ILI)通常由生物性因素等引起，常见的原因为病毒感染，如乙型肝炎病毒 (HBV)、丙型肝炎病毒 (HCV)等病毒的感染。有研究表明，免疫性肝损伤动物模型的病理改变及肝细胞损伤机制均与病毒性肝炎相类似［1～5］。近年来的研究表明，自由基引起的生物膜脂质过氧化反应，在肝损伤与肝纤维化的发病机制中起着非常重要的作用。SOD作为清除自由基的重要酶类之一，其活力的高低间接反应了机体清除自由基的能力;而MDA作为自由基作用于脂质发生过氧化反应的终产物，可反映机体内脂质过氧化的程度，间接地反映细胞损伤的程度［6，7］。GSH-Px是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解的酶，一般认为它在细胞内能清除有害的过氧化物代谢产物，阻断脂质过氧化链锁反应，从而起到保护细胞膜结构和功能完整的作用。TNF-α是一种主要由单核巨噬细胞分泌的具有多种生物活性的多肽调节因子，TNF-α既能直接损伤肝细胞，又能参与肝脏炎症、肝细胞再生等病理生理过程［8］。

中医学认为免疫性肝损伤是在人体正气不足基础上，湿热疫毒侵于血分所致。其病因为机体禀赋薄弱、素体亏虚、正气不足，外感湿热疫毒之邪。其发病机理是由于“湿热疫毒”乘机体正虚而入，蕴伏于肝，损伤肝脾，继而及肾。其病位在肝，涉及脾、肾、胃、胆等脏器［9～11］。肝脾调补方由党参、白芍、郁金、甘草、当归、茯苓、半夏、白术、柴胡、陈皮、鸡内金等药物组成，具有疏肝理气健脾的作用。临床研究证实其有改善患者临床症状、降低ALT、AST和总胆红素、促进HBV DNA转阴的作用［12］，能阻止胶原肝内沉积，抑制肝纤维化，减轻肝脏炎症，促进肝细胞功能恢复，从而降低肝纤维化指标［13］。

本实验观察结果表明，肝脾调补方可明显降低免疫性肝损伤小鼠血清中ALT、AST、TNF-α水平;减少肝组织匀浆的MDA含量，升高肝匀浆SOD、GSH-Px含量。表明肝脾调补方通过提高SOD的活力，加速MDA的清除，从而抑制机体的脂质过氧化反应，提高机体对自由基的清除能力，减少炎性细胞因子的产生，达到减轻肝细胞损伤作用。

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