干法糖基化改性提高大豆分离蛋白的乳化性

赵海贤，于国萍

（东北农业大学食品学院，黑龙江 哈尔滨 150030）

大豆分离蛋白含人体所必需的8种氨基酸，且比例比较合理，现已成为重要的蛋白资源和优良的食品原料[1]。在大豆分离蛋白的制备和加工过程中,应用不同的处理方法,都会引起蛋白质理化性质发生变化,经适当改性可产生所期望功能性质,提高其作为功能性成分在食品工业中应用。

目前蛋白质的改性有物理、化学和酶等方法。糖基化改性是化学改性的一种，该反应基于美拉德（Maillard）反应，不需要任何化学试剂作为催化剂，仅加热就可使该反应自发地进行，经接枝改性的蛋白质功能性有很大的提高，是目前蛋白改性众多方法中较为理想的方法[2]。

乳化性是蛋白质可应用性的一个很重要的指标，它与蛋白质的溶解性、凝胶性和起泡性等有着密切的关系，直接关系到蛋白质在食品工业中的应用，因而通过改性提高蛋白的乳化性是及其必要的。已有文献报道，糖基化改性是提高蛋白乳化性的一种有效途径。Nakamura等合成的溶菌酶-葡聚糖的共价复合物具有很好的乳化特性，并且提高了溶菌酶的抗菌范围[3]，Moreno将酪蛋白与乳糖在40℃条件下反应，乳化性得到明显改善[4]。本论文旨在通过糖基化改性，使大豆分离蛋白与葡聚糖发生干法接枝反应，改善大豆分离蛋白的乳化性能，从而实现大豆分离蛋白功能特性的有效改善和充分利用，解决植物蛋白开发功能性食品配料的问题。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大豆分离蛋白：哈尔滨高科大豆食品公司；非转基因九三大豆油：市售；葡聚糖2万（右旋糖酐）：Sigma公司。

FD-1PF冷冻干燥机：上海田枫实业有限公司；YQ-3型电动匀浆机：江苏江阴科研器械厂；722-2000型分光光度计：山东高密彩虹分析仪器有限公司；BIO-RAD Mini-PROTEAN Tetra Cell电泳仪：美国伯乐公司。

1.2 方法

1.2.1 糖基化蛋白的制备

将不同质量比的大豆分离蛋白与葡聚糖的混合物溶于pH 7.8,0.067 mol/L的磷酸盐缓冲液中[蛋白浓度5%（g/mL）]，磁力搅拌使其充分溶解，然后将混合液冷冻干燥，将冷冻干燥的固体样品磨碎达到2种原料充分混合的效果。将一定量的粉末装入称量瓶中，放在装有KBr饱和溶液的密闭容器中（相对湿度为79%），在60℃下进行Maillard反应制备糖基化蛋白[5]，分别在不同的时间取样待测。

1.2.2 乳化活性和乳化稳定性的测定

采用浊度法[6]，具体操作如下：

将糖基化蛋白样品溶于pH 7.0的0.2 mol/L的磷酸盐缓冲液中，使其浓度为0.1%（g/mL），取30 mL的待测糖基化蛋白样品溶液，加入10 mL的大豆油，在10000 r/min转速下分散1 min，分别于0和10 min从溶液底部吸取100μL乳浊液，加到10 mL 0.1%SDS溶液中，于500 nm处测定吸光值，以0.1%SDS溶液为空白。用零时刻的吸光值A0表示乳化活性（EA），乳化稳定性用ES＝A0×10/（A0－A10）表示，其中A10－将乳状液放置10 min后测得的乳化活性值。

1.2.3 各种因素对糖基化蛋白乳化性的影响

1.2.3.1 干热反应时间对糖基化蛋白乳化性的影响

在糖-蛋白质量比为 2∶1，pH=7.8，T=60 ℃，相对湿度79%的条件下，改变反应时间分别为 6、12、18、24、30 h，制备糖基化蛋白，按1.2.2方法测定糖基化蛋白的乳化性。

1.2.3.2 干热反应温度对糖基化蛋白乳化性的影响

在糖-蛋白质量比为 2∶1，pH=7.8，t=18 h，相对湿度79%的条件下，改变反应温度分别为40、50、60、70、80℃，制备糖基化蛋白，按1.2.2方法测定糖基化蛋白的乳化性。

1.2.3.3 糖-蛋白质量比对糖基化蛋白乳化性的影响

在温度60℃，反应时间18 h，pH 7.8，大豆分离蛋白用量不变的条件下，改变糖-蛋白质量比分别为1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1，制备糖基化蛋白，按 1.2.2 方法测定糖基化蛋白的乳化性。

1.2.3.4 乳化体系的pH对糖基化蛋白乳化性的影响

在糖-蛋白质量比为 2∶1，t=18 h，T=60 ℃，pH 7.8，相对湿度79%的条件下制备糖基化蛋白，改变乳化体系的 pH 分别为 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12[7]，按 1.2.2方法测定糖基化蛋白的乳化性。

1.2.4 糖基化改性提高大豆分离蛋白乳化性条件的优化

影响Maillard反应的因素很多，出于实验的综合考虑，确定相对湿度为79%，乳化液中蛋白浓度为0.1%，分别对糖蛋白制备的反应时间，反应温度，糖-蛋白质量比，乳化液的pH进行四因素三水平L9（34）正交设计试验。

1.2.5 凝胶电泳分析

糖基化蛋白分子量的分布用十二烷基磺酸钠聚丙烯酸胺凝胶电泳（SDS－PAGE）进行分析。SDS-PAGE凝胶配方为：10%分离胶和5%浓缩胶（含0.1%SDS）。浓缩胶电压控制在80 V，分离胶电流控制在120 V[8]。

1.2.6 数据统计及分析

文中数据为3次测定值的平均值±标准偏差。采用SPSS13.0软件的One Way ANOVA对数据进行显著性分析（p＜0.05）。

2 结果与讨论

2.1 干热反应时间对糖基化蛋白乳化性的影响

干热反应时间对糖基化蛋白乳化性的影响如图1所示。

从图1中可以看出，不同时间的大豆分离蛋白-葡聚糖干热反应复合物的乳化能力均有很大程度提高。统计结果表明，当反应时间小于18 h时，时间对乳化活性（EA）的影响显著（P<0.05），当时间达到18 h后，乳化活性增长趋势渐缓，而乳化稳定性随着反应时间的延长呈现先增加后降低的趋势，在反应时间为18 h时，乳化稳定性（ES）达到最大值。

蛋白质与多糖的接枝反应中，反应开始时，随着加热时间的延长，蛋白质结构部分展开，多糖与蛋白质受热逐步结合，促进SPI球状分子伸展，疏水基团暴露，从而大大提高了溶液的乳化活性。但是加热时间过长，一方面使蛋白质分子的一些赖氨酸被破坏，另一方面造成蛋白质结构的伸展，增加蛋白质的相互作用，导致凝聚和沉淀，不利于蛋白质与多糖发生相互作用[9]。而且随着时间的进行，混合样品的颜色由浅变深（即发生Maillard褐变），不利于产品的应用。因此时间选择在18 h，乳化活性（EA）和乳化稳定性（ES）都较高，分别是其相同条件下对照样（反应时间为0 h）的1.63倍和1.81倍，且褐变程度相对较小。

2.2 干热反应温度对糖基化蛋白乳化性的影响

干热反应温度对糖基化蛋白乳化性的影响如图2所示。

统计结果表明，温度对复合物乳化性的影响显著（P<0.05）。大豆分离蛋白的乳化活性和乳化稳定性随着反应温度的升高呈现先上升后下降的趋势。当温度小于60℃时，乳化活性随着温度的升高而上升。当温度大于60℃时，乳化活性随着温度的升高而下降。而对于乳化稳定性来说，温度为70℃时最好，但随着温度的升高，副反应（Maillard褐变）程度加深，所以选择60℃为反应温度。此时乳化活性和乳化稳定性均较高，分别是其相同条件下对照样（反应时间为0 h）的1.57倍和1.32倍。

2.3 糖-蛋白质量比对糖基化蛋白乳化性的影响

糖-蛋白质量比对糖基化蛋白乳化性的影响如图3所示。统计结果表明，底物配比对乳化活性和乳化稳定性的影响显著（P<0.05）。乳化活性和乳化稳定性都是随着底物配比的升高呈现先上升后下降的趋势，在葡聚糖与蛋白之比为2∶1时，二者均取得最大值。此时乳化活性和乳化稳定性是相同条件下蛋白对照样（反应时间为0 h）的1.52倍和1.70倍。

蛋白和多糖的分子间共价键合是在一定的基团间进行的。为了得到具有一定乳化能力的复合物,要求反应物的配比适当,以期实现最佳比例的键合。理想的产物应该是蛋白的一部分疏水基团与多糖发生共价键合增加复合物的亲水性，但又能保留有足够的疏水基团来维持产物的表面活性[10]。适当的底物配比不仅可以提高反应的速度和最终的反应程度，而且还可以减少副反应（如焦糖化）的发生[11]。

2.4 乳化液的pH对糖基化蛋白乳化性的影响

不同pH下糖基化改性大豆分离蛋白和大豆分离蛋白的乳化性的变化如图4，图5所示。

图4显示大豆分离蛋白的乳化活性受pH影响较大，相同pH下糖基化改性大豆分离蛋白的乳化活性明显高于未改性的大豆分离蛋白。在pH 3～5之间，由于等电点的出现，使其溶解性下降，因而导致了其乳化活性的下降，随后乳化活性呈缓慢上升的趋势，直到pH达到8时，乳化活性达到最大，随后随着pH的增大，乳化活性成下降趋势；乳化稳定性的变化趋势（见图5）与乳化活性相似，只是糖基化产物的乳化稳定性的最高的pH为7.0.这可能是因为在强碱条件下

SPI降解成小分子，减少了相互作用，体系对油的包容作用减弱，从而乳化性能下降[12]。

2.5 糖基化改性提高糖基化蛋白乳化性条件的优化正交试验设计及结果分析见表1，表2，表3。

表1 L9（34）正交试验结果Table 1 Result of L9(34)orthogonal experiment

表2 正交试验结果分析（乳化活性）Table 2 Analysis of L9(34)orthogonal experiment(emulsifying activity)

表3 正交试验结果分析（乳化稳定性）Table 3 Analysis of L9(34)orthogonal experiment(emulsifying stability)

正交试验结果分析见表2和表3，由表2可以得出干法糖基化改性提高大豆分离蛋白乳化活性的最佳工艺条件为A3B3C2D3。即：反应温度70℃，反应时间24 h，糖-蛋白（2∶1），pH 8。其影响因素的重要性依次为：反应温度>反应时间>pH>底物配比。由表3可以得出干法糖基化改性提高大豆分离蛋白乳化稳定性的最佳工艺条件为 C3B3A3D3，即：糖-蛋白（3∶1），反应时间24 h，反应温度70℃，pH 8。其影响因素的重要性依次为：底物配比>反应时间>反应温度>pH。由此可知本试验检测的几个条件对糖基化蛋白乳化活性和乳化稳定性的影响是不完全相同的，在反应温度70℃，反应时间24 h，pH 8的条件下，糖-蛋白比为 2∶1时，糖基化蛋白的乳化活性最高。而糖-蛋白比为3∶1时，乳化稳定最高，在各自最佳条件进行验证实验，制得糖基化蛋白的乳化活性为0.83，乳化稳定性为59.28，分别是其相同条件下对照样的1.66倍和2.06倍。

2.6 SDS-PAGE分析

为了证实大豆分离蛋白-葡聚糖之间发生接枝反应，进行了SDS-PAGE分析。电泳结果如图6示。

图6 SPI及SPI-D糖基化蛋白SDS-PAGE电泳图Fig.6 SDS-PAGE analysis of SPI and SPI-D conjugates

图谱显示，改性后，糖基化蛋白的电泳谱带相对于SPI的谱带来说，分子质量大于31000的蛋白条带基本消失，而在分离胶顶端出现了明显的高分子量的蛋白条带，说明SPI中较大分子质量的亚基与葡聚糖作用，形成分子量更大的糖基化蛋白。

3 结论

1）以乳化活性为指标，确定大豆分离蛋白-葡聚糖干法改性最佳工艺条件为：反应温度70℃，反应时间24 h，糖-蛋白质量比为2∶1，乳化液的pH为8.0，此时糖基化蛋白的乳化活性为0.83，是其相同条件下对照样的1.66倍。

2）以乳化稳定性为指标，确定大豆分离蛋白-葡聚糖干法改性最佳工艺条件为：糖-蛋白（3∶1），反应时间24 h，反应温度70℃，乳化液的pH 8.0，此时糖基化蛋白的乳化稳定性为59.28，是其相同条件下对照样的2.06倍。

3）SDS-PAGE结果证实大豆分离蛋白经干法糖基化改性生成了糖基化蛋白。

[1]杨凯,童正明,戴杏云.大豆分离蛋白的性质分析与改性研究[J].食品研究与开发,2006,27(7):87-89

[2]Chee-Yuen Gan,Lai-Hoong Cheng,Azhar Mat Easa.Physicochemical properties and microstructures of soy protein isolate gels produced using combined cross-linking treatments of microbial transg - lutaminase and Maillard cross-linking[J].Food research international,2008(41):600-605

[3]Nakamura S,Kato A,Kobayashi K.New antimicrobial characteristics of lysozyme-dextran conjugate[J].Journal of agricultural and food chemistry,2000,39:647-650

[4]Moreno F,Lopez-Fandino R,Olano A.Characterization and functional properties of lactosyl caseinomacropeptide conjugates[J].J Agric Food Chem,2002,50(18):5179-5184

[5]Akio Kato,Youko Sasaki,Ritsuko Furuta,et al.Functional protein - polysaccharide conjugate prepared by controlled dry-heating of ovalbumin-dextran mixtures[J].Agric Biol Chem,1990,54(1):107-112

[6]Tang S,Hrttiarachchy N S,Horax R E,et al.Physicochemical properties and functionality of rice bran protein hydrolyzate prepared from heat-stabilized defatted rice bran with the aid of enzymes[J].Journal of food science,2003,68(1):152-157

[7]周先碗,胡晓倩.生物化学仪器分析与实验技术[M].北京:化学工业出版社,2002:316-321

[8]Zheng Heng-Guang,Yang Xiao-Quan,Tang Chuan-He,et al.Preparation of soluble soybean protein aggregates(SSPA)from insoluble soybean protein concentrates (SPC)and its functional properties[J].Food research international,2008(41):154-164

[9]刘娟,王璋,卢蓉蓉.酪蛋白-葡聚糖接枝改性研究[D].江南大学,2008

[10]Tang Chuan-He,Ma Ching-Yun.Heat-induced modications in the functional and structural properties of vicilin-rich protein isolate from kidney(Phaseolus vulgarisL.)bean[J].Food chemistry,2009(115):859-866

[11]Diftis V Kiosseoglou.Physicochemical properties of dry-heated soy protein isolate-dextran mixtures[J].Food chemistry,2006(96):228-233

[12]Scaman C,Nakai S,Aminlari M.Effect of pH,temperature and sodium bisufite or cysteine on the level of Maillard-based conjugation of lasozyme with dextran,galactomannan and mannan[J].Food chemistry,2006(99):368-380