HPLC法测定紫果西番莲叶中白杨素的含量Δ

赵瑞瑞，邹江冰，孔秋玲，蒋琳兰（广州军区广州总医院药剂科，广州510010）

紫果西番莲Passiflora edulis Sims是西番莲科西番莲属植物，是我国栽种面积最广泛的品种之一，目前在我国台湾、福建、广东、广西和云南等地均有栽培[1]。其果实因具有怡人的香味与丰富的营养而深受人们喜爱。在北美及欧洲，多种西番莲叶提取物已作药用，具有抗氧化、抗焦虑、镇静、抗菌消炎、利尿、滋补等作用[2]，在治疗酒精、尼古丁、吗啡以及大麻酚的药物成瘾性上也有很好的疗效[3]。西番莲叶提取物在一些国家已被批准临床应用，并被正式列入了美国药典、英国药典、巴西药典、瑞典药典以及其他一些国家的药典[4]。

1 仪器与试药

515 HPLC系统，含1525二元高压梯度泵、717自动进样器、2487双吸光度检测器、Breeze工作站（美国Waters公司）；JA1003电子分析天平（上海精科天平仪器厂）；TP-320A电子天平（湘仪天平仪器设备有限公司）；UV-POWER紫外-可见分光光度计（北京莱伯泰科仪器有限公司）。

柱色谱硅胶、硅胶G板（青岛海洋化工厂）；白杨素标准品（上海同田生物科技有限公司，纯度＞98%）；流动相所用乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。紫果西番莲叶购于广东梅州市五华县百香果园（批号：20091201），经广东药学院中药学院田素英教授鉴定为真品，风干粉碎过80目筛后贮藏于广州军区广州总医院药剂科实验室。

2 方法与结果

2.1 检测波长的选择

应用紫外-可见分光光度计在190～400 nm波长范围内对白杨素标准品进行最佳吸收波长扫描，发现其在220、267、315 nm波长处有较好吸收，且在220 nm波长处具有最佳吸收，故本试验选定检测波长为220 nm。

2.2 色谱条件

色谱柱：依利特Hypersil ODS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.1%磷酸（18∶82）；流速：1.0 mL·min－1；柱温：30 ℃；进样量：10 μL；检测波长：220 nm。

2.3 溶液的制备

2.3.1 标准品贮备液 精密称取白杨素标准品3.000 mg，置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为白杨素标准品贮备液。

2.3.2 供试品溶液 称取紫果西番莲叶粉末234.0 g，用60%乙醇（料液比1∶30）于60℃加热回流提取2次，每次2 h，减压回收溶剂得浸膏，用水分散后依次以石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇等溶剂采用索式萃取器提取。正丁醇（15.0 g）部分经硅胶柱色谱分离、乙酸乙酯-丙酮梯度洗脱，得Fr.2组分4.0 g。再以乙酸乙酯-正丁醇-甲醇（2∶2∶1）为洗脱剂对Fr.2进行硅胶柱纯化，得供试品。取标准品与供试品的甲醇溶液，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇-丁酮（9.4∶0.3∶0.3）为展开剂，展开，取出，晾干，置碘缸中检视，两者在相应位置出现相同颜色斑点[9]，故初步确认供试品为白杨素。精密称取供试品5.000 mg，加甲醇溶解并定容至3 mL，用0.45 μm微孔滤膜滤过后进行HPLC分析。色谱见图1。

2.4 线性关系考察

精密量取白杨素标准品溶液0.5、1、2、4、5 mL，置于5 mL容量瓶中，加甲醇定容，制成每1 mL分别含0.012、0.024、0.048、0.096、0.120 mg白杨素的系列浓度溶液，各进样10µL，按上述色谱条件测定峰面积。以白杨素浓度（X，mg·mL－1）为横坐标，峰面积积分值（Y）为纵坐标，制备标准曲线，得回归方程为Y＝986863X+1305.7（r＝0.9980，n＝5）。结果表明，白杨素的检测浓度在0.012～0.120 mg·mL－1范围内与峰面积积分值呈良好线性关系。

2.5 精密度试验

取白杨素标准品溶液适量，重复进样5次，记录峰面积。结果，RSD＝1.12%（n＝5），表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

精密吸取同一供试品溶液适量，分别于制备后0、4、8、12、24 h进样，记录峰面积。结果，RSD＝1.01%（n＝5），表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.7 重复性试验

精密称取同一批供试品5.000 mg，共6份，分别按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，记录峰面积，计算白杨素的平均含量。结果，RSD＝1.78%（n＝5），表明本方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验

精密称取已知白杨素含量的紫果西番莲叶提取物适量，共6份，分别精密加入白杨素标准品溶液适量，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件进样10 μL，依法测定，计算加样回收率，结果见表1。

2.9 样品含量测定

取3个批次的紫果西番莲叶样品适量，分别按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件分离、测定，以外标法计算样品含量。结果，3批样品中白杨素含量分别为0.0485%、0.0479%、0.0489%，平均含量为0.0484%，RSD＝1.04%（n＝3）。

3 讨论

表1 加样回收率试验结果（n＝6）Tab 1 Result of recovery tests（n＝6）

目前，从西番莲属植物中分离得到的黄酮类化合物已有20余种，但是从紫果西番莲叶中分离得到的黄酮类化合物却很少。由于紫果西番莲叶中黄酮类化合物含量低等原因，对其分离、纯化比较困难，应用HPLC法测定紫果西番莲叶中单体化合物的含量就成为一种较可行的方式。本试验首先采用硅胶柱色谱分离法对紫果西番莲叶的粗提物进行活性成分富集，然后采用薄层色谱法对其中的白杨素进行鉴定，并用HPLC法对其含量进行测定，方法准确、可靠、重复性好，可为紫果西番莲叶中化学成分的分析测定提供新的方法和参考，并可广泛用于西番莲属植物中白杨素含量的测定。

[1]周玉娟，谈 锋，邓 君.西番莲属植物的研究进展[J].中国中药杂志，2008，33（15）：1789.

[2]邹江冰，袁 进.2种西番莲叶中黄酮的抗氧化活性研究[J].中国药房，2010，21（35）：3280.

[3]Kamaldeep Dhawan，Suresh Kumar，Anupam Sharma.Suppression of alcohol-cessation-oriented hyper-anxiety by the benzoflavone moiety of Passiflora incarnata Linneaus in mice[J].J Ethnopharmacol，2002，81（2）：239.

[4]Kamaldeep Dhawan，Suresh Kumar，Anupam Sharma.Anti-anxiety studies on extracts of Passiflora incarnata Linneaus[J].J Ethnopharmacol，2001，78（2-3）：165.

[5]Salguero B，Ardenghi P，Dias M，et al.Anxiolytic natural and synthetic flavonoid ligands of the central benzodiazepine receptor have no effect on memory tasks in rats[J].Pharmacol Biochem Behav，1997，58（4）：887.

[6]Wolfman C，Viola H，Paladini A，et al.Possible anxiolytic effects of chrysin，a central benzodiazepine receptor ligand isolated from Passiflora caerulea[J].Pharmacol Biochem Behav，1994，47（1）：1.

[7]Brown E，Hurd NS，McCall S，et al.Evaluation of the anxiolytic effects of chrysin：a Passiflora incarnata extract，in the laboratory rat[J].AANA J，2007，75（5）：333.

[8]Sena LM，Zucolotto SM，Reginatto FH，et al.Neuropharmacological activity of the pericarp of Passiflora edulis flavicarpa degener：putative involvement of C-glycosylflavonoids[J].Exp Biol Med（Maywood），2009，234（8）：967.

[9]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[S].2010年版.北京：中国医药科技出版社，2010：336.