丁鲑鱼维氏气单胞菌的鉴定和生物学特性研究

苟小兰 ，王 利 *，侯显耀 ，龙钟明 ，魏 勇 ，黄文明

（1.西南民族大学生命科学与技术学院，动物遗传育种学国家民委教育部重点实验室，四川 成都 610041；2.四川省南充市畜牧局，四川 南充 637600；3.四川省畜牧科学研究院，四川 成都 610066）

本试验观测了成都某丁鲑鱼养殖场的发病情况，发现病鱼主要表现为行动迟缓、体表鳞片大面积脱落、体表局部充血等症状，剖检可见主要脏器已发生不同程度病变。从病鱼体内分离得到了一株细菌，采用细菌常规分离培养方法、16S rDNA序列扩增分析及构建系统进化树，对该菌进行了鉴定和生物学特性研究，现报告如下。

1 材料和方法

1.1 样品来源 试验鱼来源于成都某丁鲑鱼养殖场，体长6.0cm，体重15.0g。

1.2 主要仪器及试剂 PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统；生化鉴定药品均购于杭州微生物试剂有限公司，麦康凯琼脂（北京奥博星生物技术有限责任公司生产），营养琼脂（北京奥博星生物技术有限责任公司生 产），TaqMix、DNA Marker DL2000， 购 自 Tiangen Biotech（Beijing）。

1.3 细菌分离培养 无菌操作下分别挑取丁鲑鱼肾脏、肝脏、心脏组织于麦康凯琼脂培养基上，28℃培养24 h，选取形态均一的优势菌群，挑取单菌落反复划线纯化，纯化所得菌株于4℃保存。再将保存菌株划线接种于营养琼脂平板上，28℃培养，观察菌落形态，挑取单个菌落进行革兰氏染色，在光学显微镜下观察菌体形态。

1.4 生理生化鉴定 将纯培养菌株穿刺接种于细菌生化特性鉴定管中，参照生化反应管使用说明书，对分离纯化培养物进行鉴定。

1.5 16S rDNA基因的扩增和测序 挑取单个菌落于灭菌水中，-80℃冻存1h后，立即置于100℃沸水浴20min，然后4℃ 12000r/min离心5min，取上清液作为PCR模板。采用细菌16S rDNA通用引物：上游引物 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTTAG-3′，下游引物 5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′，进行PCR体外扩增，引物均由上海生工生物工程有限公司合成。50μL反应体系中含有：模板4μL，上游引物、下游引物各2μL（引物浓度均为 10 μmol/L），Taq Mix 25 μL，ddH2O 19μL。PCR反应程序：94℃预变性4min；94℃ 30s、60℃30s、72℃ 4min，5 个循环；94℃ 30s、55℃ 30s、72℃4min，5 个循环；94℃ 30s、50℃ 30s、72℃ 4min，30 个循环。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，并将阳性样品送交北京六合华大基因科技股份有限公司进行测序。

1.6 系统发育树的构建 利用Blastn系统对分离菌株的16S rDNA序列与GenBank中的相关亲近物种进行同源性检索，找出相似性最高的菌株及同属菌株作为内群，另选取弧菌（Vibrio）作外群。运用ClustalX2.0软件进行多序列比对，再用MEGA5.0软件包中的Neighbour-Joining法构建系统进化树，采用Kimura 2-parameter作为校正模型，自举1000次（Boostrap）进行置信度检测。

2 结果

2.1 细菌分离培养 从被检丁鲑鱼的肾脏、肝脏、心脏组织分离纯化培养得到形态均一的细菌，该菌在LB培养基上生长良好，其表面略有菌膜。在麦康凯培养基上经28℃培养20h后，菌落呈现出表面光滑湿润、圆形、向上隆起、边缘整齐、乳白色。营养琼脂平板上可观察到灰白色半透明湿润菌落。革兰氏镜检表明，该菌为革兰氏阴性杆菌，菌体呈两端钝圆，多单个或两两并排存在。

2.2 生理生化鉴定 菌株XN602具动力性；不发酵鼠李糖、侧金盏花醇、山梨醇等；H2S、尿素、蛋白胨水呈阴性；β-半乳糖苷酶、VP试验、柠檬酸盐等呈阳性，其他生理生化特性见表1。参照《伯杰氏系统细菌学手册》，初步判定该菌株为维氏气单胞菌。

表1 分离菌生化鉴定结果

2.3 16S rDNA基因扩增 以菌株XN602为模板，对其16S rDNA通用引物进行体外扩增，产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，最终扩增出长度大小约为1500bp的PCR产物，结果见图1。经由六合华大基因科技股份有限公司测序，得到实为1468bp大小的PCR产物片段，将此序列提交至GenBank（登录号为JQ013893）Blastn程序比对分析，显示菌株XN602的16S rDNA扩增产物与GenBank中维氏气单胞菌分离株的相似性最高达99%。

图1 菌株XN602 16S rDNA基因PCR扩增产物

2.4 系统进化分析 选取相似度较高的同种菌株及相关同属菌株运用ClustalX2.0与MEGA5.0软件构建系统进化树，结果如图2所示。分离菌株的Bootstrap自举检验值达1000次，同时在系统发育树上可以看出分离细菌XN602（图中用“●”标注）与气单胞菌属聚为一个类群，且与维氏气单胞菌聚为一个分支，明显同弧菌属分开，由此可推断此次分离得到的细菌为维氏气单胞菌（A.veronii）。

图2 菌株XN602 16S rDNA系统发育进化树

3 讨论

3.1 维氏气单胞菌又被称为维罗纳气单胞菌、凡隆气单胞菌和维隆气单胞菌，该菌为近年来发现鉴定的一个新种气单胞菌。已知维氏气单胞菌普遍存在于各种水体、淤泥等环境中，广泛分布于世界各地。其中一部分菌株在微生态环境中能正常存在，而另一部分菌株如嗜水气单胞菌、温和气单胞菌等则具有强的致病性，可引起水产动物的大量死亡。已有报道证实维氏气单胞菌是感染鲶鱼、西伯利亚鲟、中华绒鳌蟹、镜框鲤、锦鲤、斑点叉尾鮰等的主要细菌之一。最近有研究表明该类菌可感染人体，通常引起患者发生急性腹泻，也可引起菌血症、脑膜炎和心内膜炎等疾病；也有报道称维氏气单胞菌能引起人类肺炎。众多实验及病例表明维氏气单胞菌已成为一种人鱼共患的致病菌，已对水产养殖业和人类健康逐渐构成了严重的威胁。

3.2 从患病丁鲑鱼中分离得到了菌株XN602，根据对细菌的形态学特征、生理生化特性等鉴定初步确定为维氏气单胞菌，但菌株XN602又与维氏气单胞菌的模式菌株存在一定差异，如鸟氨酸呈阳性、精氨酸呈阴性等，因而不能对分离菌进行准确的判定。近年来随着分子生物学的发展，科研工作者将基于16S rRNA的分析方法引入到原核生物分子层次的鉴定后，该方法已逐步得到完善。目前，16S rDNA序列分析已广泛应用于水产动物病原菌的鉴定中，进一步提高了细菌鉴定的准确性与高效性。本试验采用一对通用引物扩增出了菌株XN602的16S rDNA片段,并对其序列进行了分析，将所获得的16S rDNA序列与GenBank数据库中已知的微生物16S rDNA序列进行同源性比对，得出该菌与维氏气单胞菌的同源性高达99%。在系统进化树上该菌株显示与其他维氏气单胞菌聚为一簇，从分子生物学水平上鉴定了分离菌株XN602为维氏气单胞菌。

3.3 本试验中，根据细菌表型特征、生理生化鉴定及系统发育学结果，可判定菌株XN602是维氏气单胞菌。而进化树上每个聚群内部之间的遗传距离很相近，反应了其亲缘关系较近，但又有差别，这在一定程度上表明了相同菌种在不同物种、不同环境间又具有一定的差异性。16S rDNA分子鉴定具有快速、简便的优点，但对于相近种的区分也有一定的困难；另外，GenBank中16S rDNA基因序列的数量也有限，而且未经过严格的筛选及检验，序列的正确与否也可能限制16S rDNA鉴定方法的准确性。综上所述，在鱼类细菌的分类鉴定中最好采用多种方法，从不同的研究水平和层次描述细菌的不同特征，从而提高鉴定菌株的准确性。

[1]汪晓慧，陆 波，王 军.欧洲丁鲑鱼引进及生态养殖试验[J].中国水产，2007，（2）：48-49.

[2]林旭元.丁鲑鱼池塘养殖技术[J].新疆农垦科技，2010，33（2）：59-61.

[3]袁 泉，颜玉成，杜 兵，等.丁鲑鱼池塘健康养殖技术试验研究[J].动物科学，2010，（3）：329-331.

[4]朱勇夫，罗远中，韩玉章，等.欧洲丁鱼岁规模化人工繁殖试验[J].渔业致富指南，2008，19（6）：69-71.

[5]王佳喜.我国丁鲑鱼的引育种养殖概况及其比较形态[J].渔业致富指南，2006，17（3）：59-60.

[6]王禄山，高培基.生物信息学应用技术[M].北京：化学工业出版社，2008：110-123.

[7]Don J.Brenner，Noel R.Krieg，James T.Staley.Bergey’s manualofsystematic bacteriology [M].Library of Congress Cataloging-in-Publication，2005，2：591-592.

[8]Adam C.Silver，David Williams，Joshua Faucher，et al.Complex evolutionary history of the Aeromonas veronii group revealed by host interaction and DNA sequence data[J].PLoS one，2011，6（2）：1751-1756.

[9]Mohamed Nawaz，Kidon Sung，Saeed A.Khan，et al.Biochemical and molecular characterization oftetracyc-line-resistant Aeromonas veronii isolated from catfish[J].Appl.Environ Microbiol，2006，72（10）：6461-6466.

[10]邓国成，江小燕，叶 星，等.草鱼出血病混合感染的嗜水气单胞菌的分离、鉴定与理化特性[J].微生物学通报，2009，36（8）：1170-1177.

[11]陈 玲，陈淑英，李汉芳，等.温和气单胞菌致热带鱼暴发急性传染病的调查[J].职业与亚健康，2001，17（12）：77-78.

[12]马志宏，杨慧，张铁梁，等.西伯利亚鲟致病性维氏气单胞菌的分离鉴定[J].微生物学报，2010，49（10）：1 290-1293.