量子点荧光技术在活体动物移植瘤方面的应用研究

李艳芬(综述)，陈 坤 ，张铁柱(审校)

(广东医学院附属医院口腔科，广东湛江524023)

恶性肿瘤是严重危害人类生命健康的最主要疾病之一。据世界卫生组织国际癌症研究中心报告:2008年全球760万人死于恶性肿瘤，新发恶性肿瘤病例约1240万，现患肿瘤患者数量达2800 万［1］。尽管人类对于恶性肿瘤的检测、诊断及治疗进行了长期、艰苦的不懈努力，但始终未能取得突破性进展。近年来，量子点以其独有的特性应用于肿瘤方面的研究已成为人们广泛关注的研究热点之一。尤其是作为一种新型荧光探针应用于肿瘤方面，如量子点在活体动物移植瘤体内外成像、靶向标记特异组织和细胞、肿瘤标志物检测及肿瘤的治疗等方面均取得了新的进展，前景十分广阔。现就近年来量子点在活体动物移植瘤模型中的应用予以综述。

1 量子点的特性及其功能化修饰

量子点，也称半导体纳米晶，它是由Ⅱ～Ⅵ族元素或Ⅲ～Ⅴ族元素组成的尺寸＜100 nm的半导体纳米微晶体，由金属核(如硒化镉)和外壳(如硫化锌)组成，这些半导体纳米微晶体由于受到量子尺寸效应和介电限域效应的影响，表现出独特的光电属性:量子点与传统的有机荧光分子材料相比，具有激发光波长范围宽且连续分布，而其发射波长的范围窄且呈对称分布，可检测到的光谱范围内同时使用多个探针，发射光谱不出现交叠。由于量子点具有尺寸可调的特性，通过改变其尺寸或内核的组分可以在很大范围内调节量子点的发射光谱，这样仅用一种波长的激发光源便可激发多种荧光，进行多元荧光检测。量子点的光稳定性好，荧光寿命长且耐光漂白，可以经受反复多次的激发，这为研究生物体活体成像及细胞中生物分子之间长时间相互作用提供了有力工具［2-6］。应用于生物医学的量子点，必须是水溶性的，这样更容易与处在水溶性环境中的生物分子(如蛋白质、DNA、肽类等)相结合。但是，无论通过金属合成还是水相合成的量子点都带有疏水的表面活性分子，而不易与生物分子相结合，必须对其表面进行修饰，使其具有良好的生物相容性。可以通过静电引力、氢键作用或特异的配体受体相互作用将生物分子结合在量子点的表面［7-8］。

2 量子点在活体动物移植瘤中的应用

多年来，在探索肿瘤的发生机制、转移机制、诊断及治疗的过程中，由于受到伦理学等方面的限制，很难在人体上完整获得对肿瘤的发生、发展及转移等过程的检查、取材等方面的资料。而活体动物在基因与遗传方面与人类较为接近，量子点极强的荧光稳定性使其在活体动物方面的研究成为可能。动物活体中量子点作为光学对比剂结合荧光成像系统可进行肿瘤的定位，实时监测肿瘤细胞的生长和转移，对肿瘤动力学的研究及指导癌症手术提供了帮助［9］。

2.1 量子点在移植瘤动物中成像 量子点优越的光学属性使其被广泛应用于生物体内肿瘤的定位成像研究。在目前的动物实验中，将近红外量子点制成特异性的生物探针，用于活体肿瘤成像、淋巴结成像及血管成像等是研究的热点之一。量子点成像作为一种新型肿瘤成像技术，将有广泛的应用前景［10］。

2.1.1 活体动物体内肿瘤成像 2004年 Gao等［11］首次对小动物体内肿瘤进行了活体成像，他们用一种新型的多功能量子点探针——聚乙二醇包被的量子点标记前列腺特异性膜抗原的抗体，经小鼠尾静脉注射，能够对动物活体内的肿瘤进行靶向，成功实现了前列腺癌模型的非损伤性成像。Diagaradjane等［12］将分别中度表达和高表达表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)的人结肠癌细胞株H CT116和DiFi接种到雄性裸鼠后腿皮下，待肿瘤生长至0.8～1 cm时，尾静脉注射10 pmol耦联了表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)的氨基化CdSeTe/ZnS量子点;作为对照，另一组裸鼠注射未耦联EGF的量子点，分别于注射后0、3 min和1、4、24 h用活体成像影像系统对吸入麻醉状态下的裸鼠进行活体成像，注射后4 h时，两组在肿瘤区域的荧光强度具有显著差异。Yang等［13］用发射波长为800 nm的量子点连接EGFR标记口腔鳞癌BcaCD885制作量子点800-EGFR探针，并通过静脉注射到高表达EGFR的动物移植瘤动物模型中，结果显示:量子点800-EGFR探针检测到BcaCD885细胞强荧光信号，量子点探针注射后肿瘤成像的最大信噪比从15 min至6 h，在裸鼠头颈移植瘤部位实现了原位在体的活体成像。这些研究结果表明，量子点标记的荧光探针在活体中能特异性地靶定肿瘤部位，为肿瘤研究提供了一种可视化实时在体观测的研究方法。

2.1.2 活体动物前哨淋巴结成像 前哨淋巴结能准确反映整个淋巴结群的状态，是肿瘤转移到达的第1站淋巴结。检测前哨淋巴结对于肿瘤的TMN分期及预后意义重大，对于精确手术范围和明确治疗方案具有指导意义。大颗粒量子点能发射高穿透性的近红外线，可用于前哨淋巴结检测。Kim等［14］将发射近红外线的Ⅱ型量子点注射入小鼠前爪及猪腹股沟皮下，在卤灯激发下实现了腋窝及腹股沟皮下1 cm深度的前哨淋巴结精确定位成像。通过量子点标志，医师可看清1 cm深组织下的前哨淋巴结，从而可准确地指导手术进行，确保前哨淋巴结的完全切除。Knapp等［15］研究报道了利用近红外量子点在犬和猪中对浸润性膀胱肿瘤的前哨淋巴结术中实时显像。黄雪蕾等［16］用近红外荧光材料量子点800标记尼妥珠单抗，制备成荧光抗体探针，经尾静脉注射到Tcca8113舌鳞癌裸鼠皮下移植瘤动物模型中，结果表明量子点800对动物模型的舌前哨林巴结示踪效果良好，能在活体内清楚地显示舌部注射后引流的颈部前哨淋巴结位置，荧光强度高、持续时间长，且长时间停留于前哨淋巴结内。这些实验均表明量子点在活体动物的前哨淋巴结成像可以非常准确地对肿瘤组织、前哨淋巴结进行定位标记，这为临床在手术中指导医师实施精确而彻底的肿瘤根治手术提供了可能的新方法。

2.1.3 活体动物内血管成像 肿瘤组织周围血管丰富，细胞生长繁殖迅速，由于通常所用有机荧光材料激发光谱窄而发射光谱宽且易发生荧光漂白，不能在体实时对多种组织成像，而量子点荧光探针以其无以比拟的优越性可用于检测肿瘤的血管变化。Morgan等［17］用牛血清白蛋白包裹的CdMnTe/Hg量子点作为血管造影剂，通过皮下注射或静脉注射到裸鼠和C3H小鼠动物模型中，结果显示，量子点能够对C3H小鼠的鳞状细胞癌血管进行定位，可以通过血液循环到达肿瘤血管，并通过对小鼠心脏的成像确定该量子点的组织穿透深度。这为通过药物进行靶向治疗提供了一条新的探索途径。Stroh等［18］将量子点、多光子成像技术和表达绿色荧光蛋白的转基因老鼠相结合，对肿瘤血管周围的细胞和组织进行研究。结果证实不同尺寸的这些纳米荧光晶体可以进入到肿瘤组织实时成像，并可从血管周围的细胞和组织中区分出肿瘤血管，还成功地利用量子点标记骨髓干细胞监测由骨髓补充到肿瘤脉管系统的过程，这为多功能的量子点用于肿瘤病理生理学研究及抗肿瘤治疗提供了一种新方法。

2.2 肿瘤标志物检测 肿瘤标志物是存在于肿瘤细胞内或肿瘤细胞表面或脱落的物质，或是宿主对肿瘤反应而产生的物质。肿瘤标志物在恶性肿瘤诊治中具有重要作用，但因其特异性和敏感性欠佳，限制了其广泛应用。量子点能够接受激发光产生荧光标志物，比传统荧光探针有明显的优越性。2003年，Wu等［19］首次将量子点连接IgG和链霉亲和素用于特异性生物标志物Her2的标记，并用一种光源对2种靶物质同时进行了成像，结果显示，量子点荧光探针能够有效的靶向标记肿瘤细胞中的Her2，并可同时对细胞进行多元性检测。Yu等［20］用硒化镉/硫化锌量子点耦联鼠抗人甲胎蛋白(α-fetoprotein，AFP)抗体来识别肝癌标志物AFP，量子点AFP抗体探针通过尾静脉注射到小鼠内。点对点激光照射获取肿瘤部位和正常组织的荧光信号:荧光主要分布在肝癌组织上，周围组织的荧光强度迅速下降，基本无非特异性分布。盘杰等［21］利用量子点的光学优点，将其作为荧光探针检测裸鼠舌鳞癌移植瘤组织切片中Bcl-2蛋白，结果显示蛋白定位准确，特异性强。认为量子点荧光探针可应用舌鳞癌裸鼠模型的肿瘤组织切片，特别是冰冻组织切片中检测特定蛋白，可实现对肿瘤组织多种蛋白的同时检测，为进一步研究口腔鳞癌动物模型中肿瘤组织的特定蛋白及蛋白组织学提供新的研究手段。

2.3 活体动物体内肿瘤转移方面的研究 肿瘤细胞的迁移和浸润与肿瘤细胞侵入周围组织细胞密切相关，对于形成转移性肿瘤非常有害。肿瘤能够通过脉管系统进行局部或者远处转移，它也是造成晚期肿瘤患者难以治愈的主要原因。动态地研究肿瘤细胞的侵袭轨迹有助于了解肿瘤细胞对正常组织的破坏作用。随着对量子点研究的不断深入，越来越多地发现量子点在肿瘤转移的检测方面具有巨大的潜力［22］。

Jaiswal等［23］和 Voura 等［24］最早探索将二氢基硫辛酸修饰的量子点标记活细胞，并将载有这种量子点且具肺转移能力的B16F10(黑素瘤)细胞通过尾静脉注入小鼠体内后，在处死的小鼠肺组织中观察到量子点发出的荧光。其研究结果表明量子点是一种优良的示踪探针，可用于研究肿瘤细胞的体内行为，并为肿瘤转移研究提供了理论基础。Shi等［25］报道，利用近红外光发射量子点连接抗前列腺特异性膜抗体后可使小鼠骨头中前列腺癌微转移灶在体显像。2008年Chen等［26］将量子点用于动物体内肝肿瘤肺转移的检测，他们将巯基乙酸修饰的水溶性量子点结合AFP单克隆抗体制备成水溶性量子点-AFP-Ab复合物探针，通过尾静脉注射到建立的肝癌肺转移模型的裸鼠体内，结果显示，该探针可精确靶向肺部转移灶，说明其对肝癌微小转移灶的检测同样具有很高的研究价值，这将有助于肝癌的早期诊断和治疗。目前，尽管量子点对肿瘤转移的研究不断深入，但是能真正地将其用于临床还需要进一步的研究。

2.4 肿瘤治疗方面的应用

2.4.1 靶向治疗 目前对于肿瘤的治疗，临床上一般采用外科切除、放射治疗及化学治疗，这些治疗方法均可导致机体不同程度的受到损伤。传统的抗肿瘤药物缺乏选择性，癌细胞靶向能力低，不良反应大。靶向治疗是指借助各种对肿瘤细胞有选择性亲和作用的物质为载体，使药物定向作用于肿瘤组织而不损伤正常组织细胞的治疗方法。由于肿瘤部位血管内皮的通透性较高，纳米粒子载药具有较小的尺寸，容易透过和在肿瘤部位聚集而获得被动靶向效应。Shenoy等［27］报道制备的聚乙烯纳米粒载药三苯氧胺较游离药物水溶性好，在血液中循环时间长，作用于乳腺癌裸鼠模型，可在肿瘤组织中高浓度蓄积，与应用游离药物的方法相比，显示出对乳腺癌的靶向性。

2.4.2 光动力学治疗 光动力学疗法治疗恶性肿瘤是近20余年兴起并不断发展的新技术，其原理是利用光敏剂选择性聚积、储留于肿瘤组织内，并能在特定波长的光照下，通过光化学或光生物学反应对瘤组织产生杀伤效应，从而达到局部治癌目的。量子点以其优越的光学特性可以用作光敏剂来介导光动力学疗法，能对目标癌细胞准确定位进行靶向治疗肿瘤而杀伤周围正常细胞，被证明利用紫外线调节的毒性作为杀死癌细胞的一种途径［28-29］。Bakalova等［30］将水溶性的硒化镉量子点连接于对白血病细胞有特异性的抗CD抗体上，将标记的白血病细胞与正常的淋巴细胞混合，在经典光敏剂存在或缺失的情况下同时受到紫外线照射，结果显示，量子点连接的抗CD使白血病细胞对紫外光照射敏感，同时证明在经典光敏剂存在的情况下可以增加其效果。这些治疗方法是利用量子点对于治疗肿瘤的新探索。

3 小结及展望

量子点作为一种新型的纳米荧光探针，以其独特的光学性能在活体动物移植瘤中的研究中得到了广泛的应用，它能够对生物体内肿瘤的发生、发展及转移提供动态的监测，对于疾病的诊断、治疗和预后提供了新的手段，更为将来能够应用于临床打下了坚实的基础，应用前景十分广阔。但是，量子点应用于生物医学领域还存在很多问题，如量子点的毒性问题，量子点的表面修饰会造成量子点空间位阻增大，以及理化性质改变的问题，量子点在体内的排泄等仍是限制其体内应用的重要因素。尽管如此，随着对量子点研究的不断深入，量子点在活体动物成像、肿瘤标志物示踪及肿瘤转移等方面已取得了一定的进展。在目前的动物移植瘤试验中，不断优化和完善量子点的性能，降低其毒性，并能通过排泄器官在体内清除，使之成为具有高敏感性及高稳定性的探针，实时动态地监测肿瘤的发生、发展及转移，为量子点探针应用于临床的诊断及治疗建立一个新的平台，是今后的研究方向。

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