子痫前期患者胎盘组织中内皮分化基因2的表达

李留霞 ，吴改英，王 宁，张 毅，郭瑞霞，张孝艳

1)郑州大学第一附属医院妇产科 郑州450052 2)郑州大学第一附属医院生物细胞治疗中心 郑州450052 3)郑州大学生物工程系郑州450001

△女，1962年11月生，博士，教授，主任医师，研究方向:妇科肿瘤和围产医学，E-mail:llxia698@163.com

子痫前期是妊娠妇女特有的疾病，以高血压和蛋白尿为主要特征，是导致孕产妇及围产儿死亡的重要原因，其发病机制至今尚不明确。血管内皮损伤及凝血异常是比较公认的子痫前期的病理机制之一［1］。研究［2］发现溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid，LPA)来源于活化的血小板，可促进血小板聚集及血栓形成，与凝血功能异常及内皮损伤有关。LPA 主要通过其G 蛋白偶联受体发挥作用，其特异性受体为内皮分化基因(endothelial differentiation gene，Edg)2、Edg3 和Edg4。作者前期的研究［3-4］发现LPA 在子痫前期妇女血中明显升高，并且与疾病的严重程度相关，子痫前期患者胎盘组织中Edg4 和Edg7 蛋白表达明显升高。该研究应用免疫组化SP法和RT-PCR 方法检测子痫前期患者胎盘组织中Edg2 蛋白和mRNA 的表达，探讨Edg2 与子痫前期发生发展的关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选择郑州大学第一附属医院2010年11月至2011年5月收治的子痫前期患者40例，其中子痫前期轻度组20例，年龄22～41(30.1±4.9)岁，孕(36.3±2.8)周;重度组20例，年龄20～42(30.2±6.1)岁，孕(33.0±4.0)周。诊断标准参考文献［1］的妊娠期高血压疾病分类标准。选取同期入院正常晚期妊娠妇女20例作为对照组，年龄21～41(29.5±0.8)岁，孕(39.3±0.1)周。排除慢性高血压、肾脏病病史、各类炎症性疾病; 对照组无妊娠并发症。

1.2 标本的采集及处理 妊娠妇女自然分娩或选择性剖宫产，胎盘娩出后，迅速取出母面中央约1.0 cm×1.0 cm×1.0 cm 的组织，避开出血、钙化、机化的部位。用生理盐水反复漂洗后，1 份用干纱布吸去表面水分，装入RNA 酶灭活的冻存管，迅速置于液氮中保存;另1 份置入甲醛溶液固定，用于免疫组化测定。

1.3 胎盘组织中Edg2 蛋白检测 将胎盘组织常规石蜡包埋，4 μm 厚连续切片。常规脱蜡至水并微波修复抗原。采用免疫组化SP 法检测，一抗为兔抗人Edg2 蛋白多克隆抗体(北京博奥森生物技术有限公司产品)，稀释100 倍使用，二抗为山羊抗兔IgG 抗体，实验步骤严格按照试剂盒说明书进行操作，以PBS 代替一抗作为阴性对照。200 倍镜下选取10 个视野，每个视野计数100 个细胞，参照Fromowitz 等［5］的综合计分法进行半定量分析，根据阳性细胞分布范围和染色强度确定Edg2 的表达水平。以胞膜或胞质出现明显的棕黄色颗粒为阳性细胞，无着色或与背景颜色一致的为阴性细胞。阳性细胞百分数:≤5%为0 分，～25%为1 分，～49%为2分，≥50%为3 分; 阳性细胞着色强度:无着色为0分，浅棕褐色为1 分，棕褐色为2 分，深褐色为3 分;两项评分相加:0～1 分为阴性，＞1 分为阳性。

1.4 胎盘组织中Edg2 mRNA 检测 采用Trizol一步法提取胎盘组织总RNA，用逆转录试剂盒(加拿大Fermentas 公司)进行反转录后行PCR 扩增。引物均根据GenBank 数据库目的基因cDNA 序列，由上海生工生物工程有限公司设计并合成。Edg2上游引物序列5’-GACCCAATACTCGGAGACTGAC-3’，下游引物序列5’-AACCACCATTACCACAAAG GTC-3’; 扩增产物大小为341 bp。内参照β-actin上游引物序列5’-CGGGAAATCGTGCGTGAC-3’，下游引物序列5’-TGGAAGGTGGACAGCGAGG -3’，扩增产物大小为434 bp。PCR 反应条件:94℃预变性90 s;94℃变性30 s，55℃退火35 s，72℃延伸1 min，35 个循环;72℃延伸5 min。PCR 扩增产物经含20 g/L 琼脂糖凝胶电泳，应用Quantity One 软件对凝胶电泳图像进行分析，以Edg2 与β-actin 条带灰度值的比值作为Edg2 mRNA 相对表达量。

1.5 统计学处理 采用SPSS 17.0 处理数据，3组胎盘组织中Edg 2 蛋白阳性表达率的比较应用χ2检验，胎盘组织中Edg2 mRNA 的相对表达量应用单因素方差分析及LSD-t 检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 3组胎盘组织中Edg2 蛋白的表达 3组胎盘组织中均可检测到Edg2 蛋白的表达，主要表达于绒毛滋养细胞和蜕膜细胞的胞质和胞膜，见图1。各组胎盘绒毛滋养和蜕膜细胞中Edg2 蛋白阳性表达率的比较见表1。

图1 3组胎盘绒毛滋养细胞(A)和蜕膜细胞(B)中Edg2 蛋白的表达(SP，×200)

表1 3组胎盘组织中Edg2 蛋白和mRNA 的表达

2.2 3组胎盘组织中Edg2 mRNA 的表达 结果见图2、表1。

图2 3组胎盘组织中Edg2 mRNA 的表达

3 讨论

LPA 是一种具有细胞间信号传导作用的多功能磷脂分子，通常以自分泌或旁分泌的形式释放到细胞外，主要通过特异性G 蛋白偶联受体发挥各种生物学功能［6］。LPA 可来源于多种细胞，主要来源于活化的血小板，血小板活化后在磷脂酶作用下水解膜磷脂产生LPA，释放入血，作为血浆的正常成分调节一些正常的生命活动［7-9］。LPA 与高血压进展与维持有关［10］。

作者前期研究［4］显示，妊娠期高血压病患者血浆LPA 水平均较正常晚孕组升高，且子痫前期患者血浆LPA 浓度最高。有研究［11］发现Edg2 能诱导细胞凋亡，可能通过非依赖LPA 途径发挥作用。据此推测，LPA 可能通过Edg2 在子痫前期患者胎盘组织细胞凋亡中发挥一定作用。LPA 可能与胎盘组织中不同组织细胞上的受体结合后发挥不同的作用:LPA 与胎盘滋养细胞受体结合后引起或通过影响其他细胞因子诱导细胞凋亡，使其母血物质交换功能下降;LPA 与胎盘蜕膜细胞受体结合，影响细胞内钙离子浓度变化，使血压升高，促使血管收缩和血小板凝集，并可能与胎盘局部血管硬化性病变有关。该研究发现，Edg2 蛋白在患者胎盘绒毛滋养和蜕膜细胞中呈高表达，Edg2 mRNA 在患者胎盘组织中呈高表达，且与疾病的严重程度有关，提示LPA 受体Edg2 可能参与了子痫前期疾病的发生。

总之，胎盘组织中LPA 受体Edg2 异常高表达可能促进子痫前期疾病的发生发展。

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