切花百合杂种胚抢救方法

栗艳龄，梁建萍，罗凤霞

（1.山西农业大学信息学院，山西太谷030801；2.山西农业大学生命科学学院，山西太谷030801；3.金陵科技学院园艺学院，江苏南京210038）

百合是百合属（Lilium）植物的总称，花型优美，花色丰富，为世界4 大切花之一。广泛用于切花栽培的品系主要有：东方百合杂种系（Oriental Lily Hybirds）、亚洲百合杂种系（Asiatic Lily Hybirds）和麝香百合杂种系（Longiflorm Lily Hybrids）[1-3]。

随着市场需求的增加，新品种选育工作受到了重视。欧美国家对百合杂交育种技术研究得比较深入，培育出了OA（东方百合×亚洲百合）、OT（东方百合×喇叭百合）、LA（麝香百合×亚洲百合）、LO（麝香百合×东方百合）等新的杂交类型，普遍认为，柱头切割、离体胚珠授粉、子房切片培养、胚珠培养、杂交幼胚离体培养等技术是目前克服受精前后障碍较有效的方法[4-6]。我国百合育种工作起步较晚，缺乏核心技术，主要依靠进口百合种球进行切花生产。

本试验采用子房切片培养、带胎座胚珠培养、胚培养系统研究栽培品种百合系内、系间适宜的胚抢救方法，主要探讨不同杂交组合基因型、不同胚龄败育胚的培养方法、不同培养条件等因素对胚抢救效果的影响，以期为我国百合育种研究提供依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试材料为东方百合杂种系（O）、亚洲百合杂种系（A）和麝香百合杂种系（L）的部分品种，并配置不同的系内和系间杂交组合（表1），由金陵科技学院园艺学院提供。

表1 系内、系间杂交组合

1.2 试验方法

1.2.1 培养方法选择 取系间杂交授粉后一定天数子房，在无菌条件下，用70%酒精进行表面消毒1 min，再用0.1%升汞消毒10～15 min，然后用无菌水冲洗3 次，采用3 种胚抢救方法——子房切片培养、带胎座胚珠培养、胚培养。子房切片培养和带胎座胚珠培养都是在授粉8～15 d后进行，其中，子房切片培养是将子房横切成8 片左右，厚度为1～2 mm[7-8]，放于子房切片培养基上；带胎座胚珠培养是从子房中切除带胎座胚珠放在带胎座胚珠培养基上，随后二者均在授粉40～70 d 将萌发胚珠单独切除，转入胚珠培养基[9]，成苗后扩繁。胚培养是在授粉40～70 d进行，在超净工作台内，子房经表面消毒后横切取出有胚种子，用尖镊子撕去种皮，在胚乳上轻轻划一下，挤出白色透明状幼胚接种到胚培养基[10]上进行培养。每日对胚珠萌发数量进行记录。不同培养方法培养基配制如表2 所示。

表2 不同培养基类型的配制方法

子房切片和带胎座胚珠培养条件：暗培养，温度25 ℃，湿度50%～60%。胚培养条件：温度25 ℃，湿度50%～60%，光强2 000～3 000 lx，光照/黑暗为16 h/8 h。

1.2.2 适宜培养基选择 取系内杂交授粉后有胚蒴果，以MS 为基本培养基，即蔗糖30 g/L，琼脂6.0 g/L，pH 值为5.8，附加不同质量浓度生长素NAA、细胞分裂素6-BA，筛选最适培养基（表3）。培养条件同胚培养。

1.2.3 不同杂交组合适宜培养时期选择 选取系内授粉后30，40，50 d 的百合蒴果，消毒（方法同1.2.1）后接种在胚培养培养基上，每组合选取20 个长势好的胚接种，调查萌发率、成苗率，且比较不同接种时期的差异，确定最适培养时期。

表3 胚培养基配方设计

2 结果与分析

2.1 不同胚抢救方法对系间杂交受精后的影响

2.1.1 子房切片培养的影响 在子房切片培养过程中，发现LA 杂交型中的白天堂×顶级组合和OA 杂交型中的索蚌×顶级组合子房切片培养1 周后，部分切片生长良好，子房壁绿色，胚珠明显膨大，由绿色变为白色（图1-A），也有部分胚珠变白后切片出现褐化现象（图1-B）；随时观察发现，胚珠上陆续有微小突起，表明胚珠开始萌发，将萌发胚珠切除进行单独培养，最终仅有1 枚胚珠能萌发（图1-C、表4）。OA 型中的西伯利亚×多安娜、OL 型中的索蚌×白天堂、AO 型中的多安娜×索蚌及LO 型组合在子房切片培养过程中，胚珠几乎不膨大，随子房壁褐化（图1-D）无法切离胚珠。其余杂交组合部分子房切片培养正常，但膨大的子房一直未萌发，其中，西伯利亚×多安娜、白天堂×西伯利亚正交组合胚珠无法切除，试验不能继续；而反交中膨大胚珠切离后则不能萌发。陈军营等[11]报道，核与质的互作不同，造成正、反交组合中正、反交之间差异较大。

表4 子房切片培养的萌发情况

2.1.2 带胎座胚珠培养的影响 带胎座胚珠培养的萌发情况如表5 所示。

表5 带胎座胚珠培养的萌发情况

由表5 可知，OA 杂交型索蚌×顶级组合有2 个胚珠萌发，LA 杂交型白天堂×顶级组合有1 个胚珠萌发，比子房切片培养中胚珠膨大切离数量多，且胚珠萌发时间提前；OA 杂交型西伯利亚×多安娜和LO 杂交型白天堂×西伯利亚组合都克服了在子房切片培养中胚珠不膨大不能进行胚珠切离的现象，可见，本试验中带胎座胚珠培养相对优于子房切片培养。但是，采用此方法的OL，AO，AL 杂交型组合仍没有胚珠萌发，周国强[12]以亚洲百合为母本、东方百合为父本的研究结果表明，能得到果实，但获得的杂种胚也不萌发。说明以亚洲百合为母本的杂交组合基因型差异较大，存在着严重的受精障碍。

2.1.3 胚培养的影响 对不同杂交型组合适时进行胚培养，仅在OA，LA，LO 杂交型中剥离出胚（表6）。OA 杂交型中索邦×顶级组合胚萌发时间相对提前，胚萌发比例高；LA 杂交型素雅×多安娜和LO 杂交型白天堂×西伯利亚组合都有胚萌发，克服了子房切片培养和带胎座胚珠培养胚珠不萌发现象。另外，胚培养没有使LA 杂交型白天堂×顶级组合胚萌发，仅发现少数胚珠中存在无胚仅有胚乳的现象，说明在培养过程中，某培养条件不合适引起了胚败育，这还有待进一步探讨。

表6 胚培养情况

2.2 不同激素配比对百合杂种胚培养的影响

由表7 可知，LL 型雪皇后×白天堂的杂种胚在仅添加有0.01 mg/L NAA 的培养基上萌发率最高，且随着6-BA 质量浓度增加，萌发率下降；LL 型素雅×白天堂和AA 型多安娜×普瑞头的杂种胚在0.1 mg/L NAA＋0.05 mg/L 6-BA的培养基上萌发率最高，说明对激素有一定要求，且需要少量6-BA 与NAA 共同发挥作用；OO型杂交组合和AA 型普瑞头×索莱尔的杂种胚在仅添加0.1 mg/L NAA 培养基上萌发率最高，且在不添加任何激素的MS 培养基上根本不萌发。可见，不同杂交基因型组合对激素质量浓度及配比要求是不一样的。

2.3 不同胚龄对百合杂种胚培养的影响

由表8 可知，OO 型杂交系列在授粉后50 d剥胚较合适，AA，LL 型杂交系列在授粉后40 d左右剥胚较适宜；且同一杂交型不同组合相同胚龄萌发率不同，如索蚌×西伯利亚30 d 胚龄杂种胚萌发率为20%，索蚌×卡萨布兰卡萌发率为0。为此，不同杂交基因型组合，胚抢救时间不一致。

表7 不同培养基上不同组合胚萌发情况

表8 不同胚培养时间不同组合胚萌发情况

3 结论与讨论

本试验采用子房切片培养和带胎座胚珠培养使OA，LA 型杂种胚萌发，且带胎座胚珠培养方法相对优于子房切片培养方法，但2 种培养方法获得的杂种苗在后期生长过程中逐渐褐化死亡或者产生愈伤组织后由绿变白死亡；据报道在授粉后5 d 就能进行子房切片和带胎座胚珠培养[8，13]，且杂交组合不同，具体的合适胚龄也不同[14]，推测胚龄选取不合适，导致萌发组合极少，萌发率极低；采用胚培养使OA，LA，LO 型杂种胚萌发，且LA 型中获得杂种胚的杂交组合与前2 种方法不一致，后期仅获得LA 型素雅×多安娜组合中1 株杂种苗，其余组合胚萌发后没有成苗或逐渐褐化死亡，说明种间不亲和性一直延续到杂种苗生长过程中，还需要对杂种后代成苗过程进一步研究。另外，3 种方法均能使OA 型索邦×顶级组合杂种胚萌发，且萌发率递增，说明对于亲和性较好杂交组合，胚培养有效性要高于其余2 种培养方法。

关于胚抢救技术问题，国内大多采用幼胚培养，国外对胚培养、子房培养、胚珠培养、心皮培养进行了广泛研究，实际上这4 种方法是对不同胚龄的胚进行研究。Chi[9]认为，子房切片培养比单胚珠培养、带胎座胚珠培养效果好，且4 种方法均没有使以亚洲百合为母本的AO，AL 型杂种胚萌发；焦雪辉等[15]也证实了以亚洲百合为母本，东方百合为父本是不亲和的。本试验认为，对于亲和性小的组合，采用带胎座胚珠培养比子房切片培养效果好，对于亲和性大的组合，仍然要采用幼胚培养，但要注意培养条件。Fernandez 等[13]研究表明，子房切片培养时间大大影响了植株苗再生。本试验中萌发的胚几乎没有成苗，可能与胚珠从子房切片或胎座中一个个转移到胚珠培养基上耗时有关；也有人报道，胚珠可直接在胎座或切片中萌发，可见，后期杂种苗再生也是不亲和性研究的一个关键环节。

本试验发现，胚龄和激素配比对胚培养的萌发率有一定影响。对于OO 型杂交组合，50 d 左右胚龄适宜培养，对生长素要求较高；对于AA，LL 型杂交组合，40 d 左右胚龄适宜培养，且不同杂交组合对激素配比要求不一。多数研究[9，16]认为，授粉后30 d 就可以进行幼胚培养。本研究对索蚌×卡萨布兰卡组合胚龄达30 d 左右的胚进行培养，萌发率为0，说明胚龄过小的胚培养成熟需要创造更好的培养条件。合理激素配比有利于胚性生长，促进胚发育成熟。前人对激素的添加比例众说纷纭，孙晓梅等[10]研究认为，生长素和细胞分裂素最优配比为0.001 mg/L NAA＋0.1 mg/L6-BA；王丹菲等[16]认为，0.01 mg/L NAA＋0.1 mg/L 6-BA 为较优组合。屈云慧等[17]认为，培养基中生长素与细胞分裂素的合理配比对控制幼胚胚性生长、促进胚发育成熟起决定性作用。本试验中不同杂交组合杂种胚萌发对激素要求存在差异，0.01～0.10 mg/L NAA 的添加是必要的。为此，在百合杂交育种中，对重要杂交组合进行胚抢救时，在激素配比上应慎重考虑。

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