中国南部沿海近岸西加鱼毒素研究

徐轶肖,王爱辉,胡 蓉,江天久,江 涛 (1.南京大学地理与海洋学院,江苏 南京 10093；.暨南大学赤潮与水环境研究中心,广东 广州 51063)

中国南部沿海近岸西加鱼毒素研究

徐轶肖1,2,王爱辉2,胡 蓉2,江天久2*,江 涛2(1.南京大学地理与海洋学院,江苏 南京 210093；2.暨南大学赤潮与水环境研究中心,广东 广州 510632)

为了查清我国南部沿海珊瑚礁鱼类体内的西加鱼毒素状况,首次在海南三亚、琼海、广西涠洲岛、珠海担杆列岛、广东徐闻县灯楼角和福建东山岛收集渔民从附近珊瑚礁海域捕捞的野生鱼类,采用酶联免疫法、小白鼠生物法和高效液相色谱质谱联用法进行毒素测定.结果表明,6个调查海区均检测出染毒鱼类,总阳性检出率达50%,其中福建东山岛(77.8%) ＞广东徐闻县灯楼角(66.7%) ＞广东珠海担杆列岛(55.6%) ＞广西涠洲岛(37.5%) ＞海南三亚(37.5%) ＞海南琼海(16.7%),与海域环境质量可能存在一定的关联.鱼组织毒素含量为 0～169ng P-CTX-1/kg肉,8个样品 (占总样 17.4%) 超过 100ng P-CTX-1/kg肉,达到可致人中毒水平.染毒鱼种类繁多,主要包括蝴蝶鱼科(Chaetodontidae)、鹦嘴鱼科(Scaridae)、鳂科(Holocentridae)、笛鲷科(Lutjanidae)和鮨科(Serranidae).酶联免疫法与小鼠生物法对鱼毒定性检测结果基本一致,但仅在福建东山岛2个鱼样中检测到P-CTX-1成分.染毒鱼类的毒素含量和鱼体重/体长没有相关性,也与其食性无关.

西加鱼毒素；珊瑚礁鱼类；酶联免疫法；小白鼠生物法；高效液相色谱质谱联用法

西加鱼毒素(CFP)是指存在热带、亚热带珊瑚礁地区一些鱼类体内的毒素,由甲藻中的冈比藻(Gambierdiscus spp)产生,通过食物链的传递,经草食鱼类、肉食鱼类而最终影响人类的生命健康.现已证实该毒素主要流行于加勒比海地区及位于 35'N～35'S之间的印度洋和太平洋地区[1].我国南部沿海地区属热带和亚热带海域,位于全球西加鱼毒主要流行区域的边缘地带,中毒事件时有发生[2-3].究其原因,一方面是因为该地区如香港、广东等地每年与南太平洋岛国之间频繁的活珊瑚鱼贸易[4-5],另一方面则因该地区邻近珊瑚礁海域存在毒鱼所致[6-7].

尽管早在20世纪70年代有学者在西沙群岛首次记录到产西加鱼毒素的原因种Gambierdiscu toxicus Rukuro & Yasuwo[8],并在1998年香港赤潮爆发事件中首次检测到香港水域亦含Gambierdiscus toxicus[9],但国内对该毒素报道仍以综述介绍为主[10-12],至今未见详尽的海域调查.本研究采用酶联免疫法、小白鼠生物法和高效液相色谱质谱联用方法,调查我国南部沿海珊瑚礁鱼类体内的西加鱼毒素状况,旨在弄清该毒素在我国的实际分布情况,为珊瑚礁鱼类管理提供依据.

1 调查区域与方法

1.1 调查站位

2007年9月至11月,在海南三亚、琼海、广西涠洲岛、珠海担杆列岛、广东徐闻县灯楼角和福建东山岛(图1)收集渔民从附近珊瑚礁海域捕捞的野生鱼类.每个站位采集6～9种鱼类,尽量挑选个体较大的样品,每种 1～2条.共采集刺豚科(Diodontidae)、鳂科(Holocentridae)、刺尾鱼科(Acanthuridae)、鹦嘴鱼科(Scaridae)和鮨科(Serranidae)等15个科46份样品.样品采集后,置于食品保鲜袋内并做好标记,冷冻保存运输至实验室,-20℃储存.

图1 西加鱼毒素调查站位Fig.1 Sampling sites on Ciguatera toxins

1.2 毒素测定方法

用于试剂盒酶联免疫检测Cigua-Check®试剂盒购自美国Oceanit Test Systems公司,操作参考产品说明书,先分别进行阳性对照和阴性对照的判断以保证该试剂盒的敏感性和有效性,然后对样品进行检测.

对试剂盒检测结果呈阳性的样品进一步用小白鼠生物法进行检测.步骤如下:

毒素的提取:称取 100g已匀浆的鱼肉样品,平均置于 4个洁净的 250mL离心管中.加注25mL氯仿、50mL甲醇,混匀 1min;再加 25mL氯仿,混匀 15s;加 25mL去离子水,混匀 15s, 2000r/min离心10min,弃去上层的甲醇/水和中层的白色固体,吸取并吹干下层的氯仿提取液.吹干物用10mL甲醇:乙腈(V:V=7:3)溶解后,加20mL正己烷,混匀,然后同上条件离心,去掉上层正己烷,液氮吹干剩下的甲醇/乙腈,残余物用 1%吐温60/0.9%生理盐水稀释(V: V =1:1)定容备用.

小鼠毒性实验:每个鱼样提取3份,每份100g.对少数几个鱼样肉组织＜300g的样品,每份提取50g.实验用小白鼠昆明品系,证号 scxk(粤)2006-0015,购自广州市第一军医大学实验动物中心,体重控制在 19～21g.实验时,将提取原液 0.5mL或1mL加热至37℃后注射入小鼠的腹腔内,每个样品重复注射3只小白鼠.记录每只小鼠的重量、注射时间、注射量、中毒症状和死亡时间,同时测定体温变化.实验观察24 h,并用注射相应体积1%吐温 60/0.9%生理盐水(V:V=1:1)溶液的小鼠为对照组.如果小鼠在40 min内死亡,需对提取原液进行稀释并重新注射观察.实验时,根据小鼠腹腔注射后是否出现典型的西加鱼毒素中毒症状[13]判断样品是否染毒.

毒力的计算和表示:样品的毒性大小用鼠单位(MU)表示.1MU表示使一只重20g的小白鼠在24h死亡所需的腹腔注射剂量.毒力的定量采用剂量-死亡时间关系方程式 logMU=3.7log (1+T-1)[14]计算,其中MU为小鼠单位,T为存活时间(用h表示).若小鼠4d内未死亡但有体温降低、体重减轻、腹泻、活动减少等症状,则样品所含毒素剂量为 0.5MU.最后根据加标回收率估算鱼肉中毒素的含量[15].

对小白鼠生物法检测的有毒鱼样以高效液相色谱质谱联用法对毒素进行定量分析.

毒素的提取:提取方法同上,只是经液氮吹干后的残余物用 5mL乙腈:乙酸铵(V:V=1:1)溶解,9500r/min离心 20min,吸取上清液用于上机检测.

系统分析条件:HPLC-MS/MS系统分析条件为:ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1mm i.d × 50mm,1.7um),柱温40℃.流动相分2路,分别是5mmol/L乙酸铵(含0.1%甲酸)和乙腈.梯度洗脱流速 0.2mL/min.采取电喷雾正离子模式,毛细电压 3.5kV,锥电压 30V,源温度 105℃,提取电压4.0V,喷雾温度 350℃,锥气流速 49mL/min,喷雾气流速 750L/h.进样量 10µL.选择西加鱼毒素P-CTX-1分子离子[M+NH4]+为前体离子进行多级反应监测(MRM),质荷比(m/z)1076和 1058的碎片离子为P-CTX-1的定性和定量离子.

2 结果

样品检测结果如表1所示.试剂盒初步检测发现 6个采样区均含有鱼毒,总阳性检出率达50%.具体到各采样区,阳性检出率从高到低依次为福建东山岛(77.8%)、广东徐闻县灯楼角(66.7%)、广东珠海担杆列岛(55.6%)、广西涠洲岛(37.5%)、海南三亚(37.5%)、海南琼海(16.7%).本调查中阳性鱼种类繁多,主要包括蝴蝶鱼科、鹦嘴鱼科、鳂科、笛鲷科和鮨科.

表1 中国南部沿海近岸鱼类的西加鱼毒素检测结果Table 1 Ciguatera toxins in coral fish along the southern coast of China

续表

续表

小白鼠法中,除样品 GDZH7之外,其他使试剂盒呈阳性的鱼样提取液均使小鼠出现典型中毒症状,如体温降低、竖毛、身体蜷缩颤抖、不时用前爪抓嘴、用嘴钳腹部、呼吸急促,有些还出现步态僵直、尾巴变黑变硬拱起,其中GDXW1还使小鼠出现后肢麻痹瘫痪.但所有实验小鼠未发现腹泻症状.由小鼠法结果可推知Cigua-Check试剂盒正确检出率高达95.7%.

腹腔注射小鼠时,HNQH1、GDXW3、GDXW6、FJDS1和FJDS3这5个鱼样提取液使2只或 3只小鼠致死,鱼肉中含毒水平分别为 155, 153,162,164,169ng P-CTX-1/kg肉.FJDS5与FJDS8含毒量均为148ng P-CTX-1/kg肉.其余15个样品尽管未使小鼠 24h内死亡, 但因出现西加鱼毒素的典型中毒症状而估算成 0.5MU, 即 70ng P-CTX-1/kg肉. P-CTX-1在肉食性鱼类组织中含量达100ng/kg肉时就会对人体构成危害[16],因此8个样品(占总样 17.4%)达到可致人中毒水平.总的来说福建东山岛样品的染毒程度比其他海区高.

挑选小鼠法检测为阳性的22份样品进一步用液质联用仪进行毒素成分分析,仅在FJDS1和FJDS3中检测到微量 P-CTX-1,分别为 70, 130ng/kg肉.其他鱼样均未能检测出 P-CTX-1.因此FJDS3一旦被人食用,可能发生中毒事件.

3 讨论

3.1 3种检测方法的比较

除GDZH7鱼样试剂盒法与小鼠法定性检测结果相异外,其余样品均相符.分析GDZH未使小鼠出现中毒症状的原因可能为鱼肉组织内毒素含量过低,不足以使小鼠产生反应,今后有必要对此类样品进行浓缩后再进行小鼠法检测,此外,可能鱼肉组织内含有的非西加鱼毒素聚醚环化合物与试剂盒免疫抗体发生交叉反应,使检测结果呈现假阳性,假阴性和假阳性是试剂盒法无可避免的问题.至于LC-MS/MS法仅检测出2个样品含有毒素,这可能是鱼体内 P-CTX-1含量较低,而依据本方法提取的鱼组织不足,导致检测样品毒素富集量低于液质联用的检测限,另外,鱼肉毒素组成除P-CTX-1外,尚含其他西加鱼毒素组分,据研究,仅太平洋法属波利尼西亚的有毒藻 G. toxicus 和珊瑚礁鱼体内就存在多达 23种西加鱼毒素[17].目前尚无中国海域西加鱼毒素组成的具体信息,可能存在多种非P-CTX-1的西加鱼毒素成分,由于缺乏毒素标准品,我国沿海西加鱼毒素的成分特征尚需进一步研究.

3.2 我国南部沿海西加鱼毒素的地理分布

本调查结果表明,我国南部福建、广东沿海的西加鱼毒素检出率高于广西、海南,这可能与我国南部沿海近岸水质环境差异有关.珊瑚礁的生长状况与水体环境质量密切相关.在水质环境差的区域,珊瑚礁“白化”现象严重,而死珊瑚上纤维状或含钙基质通常是产西加鱼毒藻Gambierdiscus spp.生长的依附物.2007年海洋环境质量公报[18-21]数据表明,琼海、三亚近岸监测海域均为清洁海域,涠洲岛水质属清洁、较清洁类,而珠海市近岸海水水质中度及以上污染,东山岛附近亦有约 40%水体中度及以上污染,由此可推知,较劣水质诸如东山、珠海近岸的珊瑚礁更易遭受破坏,而利于产毒藻密度的增加,从而使该海域直接或间接摄食该藻的珊瑚鱼染毒程度较高.徐闻近岸海域水体属清洁、较清洁类,但其样品阳性检出率仍达 66.7%,推测染毒鱼类由附近高污染海域洄游至此.然而,自 1974年在西沙群岛首次记录到 Gambierdiscu toxicus[8]以来,我国沿海尚未进行详细的Gambierdiscus spp.地域调查,亦缺乏该藻的纯培养株,因此,我国南部沿海西加鱼毒素地理分布差异的原因有待进一步考证.另外,也不排除本研究采集的这些鱼类样品为非本海域种,而由其他海域洄游至此.吕颂辉等[11]指出,我国近海染有西加鱼毒的鱼类与产毒藻存在密切联系,但不排除部分有毒鱼由境外海域洄游到我国的可能性.

本调查总染毒鱼检出率(50%)远高于邻近的日本冲绳岛(17.6%)[22],可能是因为水域环境差异,我国南部沿海水质较差,更适合Gambierdiscus spp.生长,易使珊瑚鱼染毒,此外,本研究区域更靠近赤道,终年水温较高,更适合产毒藻及珊瑚鱼生存.

3.3 染毒鱼类的特点

Oshiro等[22]的研究表明,冲绳岛海域染毒鱼体内的毒素含量和鱼体重、体长成正相关,即体重/体长越大,毒素含量越高,本调查结果未呈现上述特征,而与Pottier等[23]、Chinain等[24]的结果一致,即鱼组织内毒素的含量和鱼体重/体长没有相关性.值得注意的是,以小鼠法检测出的 22个有毒样品中肉食性鱼类和其他食性鱼类各占50%,通过HPLC-MS/MS 检出含P-CTX-1的2个鱼样FJDS1 和FJDS3, 前者为肉食性,后者属杂食性鱼类,这些均意味着我国海域染毒鱼在食性上并无明显差异,个体小的鱼类因生境及摄食习惯仍可含有较高的毒素,因此,避食大个体珊瑚鱼或肉食性珊瑚鱼并不能使消费者避免西加鱼毒中毒,使我国对该类毒素的管理面临严峻问题.

4 结论

4.1 6个调查站位均含有毒鱼,总阳性检出率达 50%,其中福建东山岛(77.8%) ＞广东徐闻县灯楼角(66.7%) ＞广东珠海担杆列岛(55.6%) ＞广西涠洲岛(37.5%) ＞海南三亚(37.5%) ＞海南琼海(16.7%),其与海域环境质量可能存在一定的关联.

4.2 染毒鱼种类繁多,主要包括蝴蝶鱼科、鹦嘴鱼科、鳂科、笛鲷科和鮨科.

4.3 免疫试剂盒法与小白鼠生物法对毒素定性检测结果基本一致,仅在福建东山岛2份鱼样中检测到P-CTX-1.

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Ciguatera toxins in coral fishes along the southern coast of China.

XU Yi-xiao1,2, WANG Ai-hui2, HU Rong2, JIANG Tian-jiu2*, JIANG Tao2(1.School of Geographical and Oceanographic Sciences, Nanjing University, Nanjing 210093, China；2.Research Center of Harmful Algae Blooms and Aquatic Environment Science, Jinan University, Guangzhou 510632, China). China Environmental Science, 2012,32(2)：330～336

The Ciguatera toxins(CTXs) in coral fish along the southern coast of China were investigated for the first time through collecting wild coral fish samples in Sanya and Qionghai of Hainan, Weizhou Island of Guangxi, Zhuhai and Xuwen Dengloujiao of Guangdong and Dongshan Island of Fujian. By using three different analysis methods including Cigua-Check® Kit, Mouse Bioassay and HPLC-MS/MS, toxic fishes existed in all six sampling areas, and the total detection rate was 50%. Respectively, the detection rate for Dongshan Island of Fujian (77.8%) ＞ Xuwen Dengloujiao of Guangdong (66.7%) ＞ Zhuhai Danganliedao of Guangdong (55.6%) ＞ Weizhou Island of Guangxi (37.5%) ＞ Sanya of Hainan (37.5%) ＞ Qionghai of Hainan(16.7%). Toxin content of fish varied in 0～169 ng P-CTX-1/kg flesh and generally showed relation to the water quality. There were eight samples, the ratio of 17.4% for total samples, exceeded 100 ng P-CTX-1/kg flesh that could poison human beings, and toxic species principally involved were Chaetodontidae, Scaridae, Holocentridae, Lutjanidae and Serranidae. Except on one sample from Zhuhai Danganliedao, Cigua-Check® kit has the same result with Mouse Bioassay on toxin qualitative analysis, while the component of CTXs, P-CTX-1 was only found in two samples of Dongshan Island, Fujian by HPLC-MS/MS. Finally, there was no significant correlation between fish toxicity and the parameters of its weight, length and feeding habits.

ciguatera toxins；coral fish；ELISA；mouse bioassay；HPLC-MS/MS

2011-05-05

国家自然科学基金资助项目(U0733006);国家“973”项目(2010CB428702);国家“908”赤潮灾害调查专项(SZ801);广东908赤潮灾害评价专项(GD908-02-14)

*责任作者,教授, tjiangtj@jnu.edu.cn

X503.225

A

1000-6923(2012)02-0330-07

徐轶肖(1977-),女,浙江兰溪人,南京大学博士研究生,主要从事海洋生态与生物毒素研究.发表论文10篇.