富硒酵母中硒蛋氨酸的GC－MS/MS测定

陈尚卫 戴 军 吴胜芳 虞锐鹏 朱 松

（江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏 无锡 214122）

富硒酵母中硒蛋氨酸的GC－MS/MS测定

陈尚卫 戴 军 吴胜芳 虞锐鹏 朱 松

（江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏 无锡 214122）

建立酵母中硒蛋氨酸含量的气相色谱——串联质谱法（GC－MS/MS）分析方法。比较3种富硒酵母中硒蛋氨酸检测样品的提取方法，优化硒蛋氨酸的酶解提取条件；以氯甲酸乙酯为衍生化试剂，2－氯苯丙氨酸为内标物，采用选择离子模式对衍生物进行GC/MS/MS检测。结果表明，硒蛋氨酸的回收率为90.0%～97.0%，检测限为4μg/L，方法精密度（RSD）为7.8%。该方法简单快捷、定量准确、灵敏度高。

富硒酵母；硒蛋氨酸；四级杆串联质谱

硒（selenium，Se）是生物体必需的微量元素之一，具有抗氧化、抗衰老、促进免疫及解毒等诸多生理活性。人体一旦缺硒就会引起一些重要器官的功能失调，导致许多严重疾病发生，动物缺硒会导致白肌病和生长缓慢等［1－3］。有研究［4，5］表明：无机硒生物活性、利用率较低，不易被肠道吸收，还具有一定毒性，摄入过量会导致急、慢性中毒。有机硒是生物体通过代谢过程将环境中的无机硒通过与体内的生物大分子相结合形成含硒有机物。有机硒补剂特别是富含硒代氨基酸的产品在毒理安全性、生理活性和吸收率上更具有优越性，而富含有机硒的富硒酵母是人与动物常见的补硒产品。硒蛋氨酸是富硒酵母中硒的主要存在形态［5，6］。

目前，硒蛋氨酸的分析检测方法主要有：液相色谱－电感耦合等离子体质谱法（LC－ICP/MS）［7］、液相色谱－氢化物发生原子荧光光谱法［8，9］、气相色谱－氢火焰离子检测法［10］、气相色谱－质谱法（GC－MS）［11］、液相色谱－电喷雾质谱法［12］、离子色谱法等［13］。但这些方法有些样品预处理繁琐，且基质干扰多，影响定性定量结果；有些仪器普及不高。目前中国针对富硒酵母中硒蛋氨酸的检测报道较少，许多厂家不得不送样品至国外检测。本试验比较了3种富硒酵母中硒蛋氨酸的提取方法，建立了富硒酵母中硒蛋氨酸的GC－MS/MS测定方法，为酵母中硒蛋氨酸的检测提供一个新的方法选项。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

超声波清洗器：KQ250DB，昆山超声波仪器有限公司；

多用途水浴恒温振荡器：DSHZ－300，江苏太仓实验设备厂；

台式离心机：Anke TGL－16C，上海安亭科学仪器厂；

电热恒温水浴锅：HHS，上海浦东荣丰科学仪器有限公司；

气质联用仪：1200LGC－MS/MS，美国瓦里安公司；

三（羟甲基）氨基甲烷（Tris）、盐酸、乙醇、氯仿、吡啶：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

氯甲酸乙酯：≥98%，瑞士Fluka公司；

2－氯苯丙氨酸：≥99%，上海翰鸿化工科技有限公司；

复合蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶、碱性蛋白酶：诺维信（中国）生物技术有限公司；

富硒酵母（样品A）：安琪酵母股份有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 酵母中硒蛋氨酸的提取［11］

（1）超声波提取：考察不同溶剂对提取硒蛋氨酸的影响。用不同的溶剂溶解样品，然后进行超声波处理。称取200mg左右样品A于25mL容量瓶中，加溶剂（水或0.1mol/L Tris缓冲液或0.1mol/L HCl等）溶解，定容后置于超声波中，在50℃下超声30min，离心过滤，滤液备用。

（2）酸解法提取：考察不同浓度盐酸对提取硒蛋氨酸的影响。称取200mg左右样品A于水解管中，分别加不同浓度的 HCl（0.1，0.4，2，4，6mol/L）10mL，充 N2后封 管，于50℃水浴中水解10h，冷却后用NaOH溶液调节pH至7，并用水定容至50mL，离心过滤，滤液备用。

（3）蛋白酶水解：考察不同的蛋白酶对提取硒蛋氨酸的影响。称取200mg左右样品A于10mL三角瓶中，加入一定量的蛋白酶，加入10mL 0.1mol/L的Tris缓冲溶液（pH 8.0），在55℃水浴摇床上反应24h，然后以10 000r/min的转速离心10min，移取上清液，用0.45μm醋酸纤维薄膜过滤，滤液备用。

1.2.2 硒氨酸的衍生化［14］取硒蛋氨酸标样溶液（1～10μg/mL）200μL至衍生化小瓶中，加入5μg/mL内标溶液200μL、乙醇200μL、吡啶50μL，充分摇匀，再加入氯甲酸乙酯（ECF）50μL充分摇匀，直至无气泡冒出。加入1%ECF氯仿500μL充分振荡，静置。取氯仿相200μL进样。样品的衍生化方法与标样相同。

1.2.3 GC－MS/MS分析条件［14］

（1） 色 谱 条 件：色 谱 柱 DB－5（30m×0.25mm×0.25μm）；进样口温度250℃；分流比10∶1；载气为 He气，恒流模式，流速1.0mL/min；程序升温，120 ℃保持1min再以15℃/min升到280℃保持5min；传输线温度250℃，进样量1μL。

（2）质谱条件：EI源，电离能70eV，离子源温度200℃，溶剂延迟3min，扫描方式：选择离子监测（SRM），检测器电压1 200V。

2 结果与讨论

2.1 酵母中硒蛋氨酸提取方法的选择

Beril Iscioglu等［15］分别试验了水、0.1mol/LTris缓冲液、0.1mol/L HCl在50℃下超声提取酵母中硒蛋氨酸，结果表明超声对酵母中硒蛋氨酸有一定的提取效果。本试验也比较了水、0.1mol/L Tris 缓冲液 （pH 8）、0.1mol/L HCl、0.4mol/L HCl、2mol/L HCl、4mol/L HCl提取溶剂按1.2.1方法超声波提取，测得样品A硒蛋氨酸含量范围为52～112μg/g，其结果比其他方法低许多，可能是由于富硒酵母中硒蛋氨酸主要以含硒蛋氨酸的蛋白形态存在，而超声不能使其蛋白充分水解，使硒蛋氨酸不能完全游离出来。

酸解法试验了0.1 ，0.4，2，4，6mol/L HCl和水解4，10，20，50h对硒蛋氨酸含量的影响，测得样品A硒蛋氨酸含量范围为216～564μg/g，可看出酸解法提取优于超声波提取，但由于硒蛋氨酸不太稳定，酸解会破坏硒蛋氨酸的结构，因此酸解法测得硒蛋氨酸的含量也不是很高。试验中加入巯基乙醇保护剂对结果也没有明显提高。

文献［11］认为酶解法效果优于酸解法，而且酶解试验条件温和对硒蛋氨酸破坏较小。本试验比较了胰蛋白酶、中性蛋白酶、复合蛋白酶、风味蛋白酶以及碱性蛋白酶在不同条件下对富硒酵母的酶解效果，测得样品A硒蛋氨酸的含量范围为556～1 764μg/g。由表1可知，酶解法提取优于超声及酸解法提取，这几种酶中以碱性蛋白酶酶解效果最好，测得硒蛋氨酸的含量最高。

表1 不同提取方法测得富硒酵母中硒蛋氨酸的含量Table 1 Content of selenomethionine detected by different extraction methods in selenium－enriched yeast

2.2 碱性蛋白酶酶解条件优化

影响酶解效果的因素主要有pH值、温度、反应时间、酶用量和底物质量分数。试验中以此确定正交试验因素水平，以L9（34）进行试验。

表2 正交因素水平表Table 2 Orthogonal factors and levels

由表2可知，四因素对酶解效果的影响顺序为B＞A＞C＞D，最佳反应条件为A2B3C1D2。在最佳条件下硒蛋氨酸的含量可达到1 898μg/g。

2.3 衍生化条件的选择

样品的衍生化处理一般要求发生反应容易、操作简便，而氯甲酸乙酯与氨基酸中的基团在溶液中易发生亲核加成反应，反应完全且反应速度较快、基本无副产物生成，是较理想的衍生化反应。而且反应的衍生化产物极性与沸点适于气相色谱分析。本试验中在室温下漩涡振荡反应30s即可使反应完全。

2.4 内标物及质谱条件的选择

由于GC－MS/MS在定量中，用外标法定量可能会有较大的误差，因此试验中采用内标法定量。本试验中选择了2－氯苯丙氨酸作为内标物，2－氯苯丙氨酸为人工合成品，自然界没有，且离子化效果好，和硒蛋氨酸能很好的分离，是硒蛋氨酸GC－MS/MS分析中较理想的内标物。

试验中选择m/z 202，128作为硒蛋氨酸衍生产物的子离子，m/z 153.9，181.5为内标衍生物的子离子进行监测，通过比较得到m/z 202，153.9分别作为硒蛋氨酸及内标物的衍生产物的子离子检测具有更高的选择性及灵敏度，因此选择了m/z 202，153.9分别作为硒蛋氨酸及内标物的衍生产物的子离子进行检测。

表3 正交试验结果Table 3 Results of orthogonal experimental

2.5 硒蛋氨酸的线性范围和检出限

分别用1，2，5，10μg/mL的标准样品溶液进样1μL，测得硒蛋氨酸在1～10μg/mL浓度范围内线性良好。以3倍信噪比作为检测限，计算得硒蛋氨酸的检测限（LOD）为4μg/L。

对同一样品进行5次重复进样得出相对标准偏差（RSD）为4.7%。对同一样品进行5个平行试验，均在同一条件下提取和衍生化，得到本方法的相对标准偏差（RSD）为7.8%。对同一样品称取200mg酵母分别加入100，250，500μg硒蛋氨酸标准品，分别酶解和衍生处理，测得回收率分别为90.0%，94.2%，97.1%。

图1 硒蛋氨酸的标准曲线Figure 1 Standard curve of selenomethionine

2.7 富硒酵母样品中硒蛋氨酸的检测

选取市场上5个富硒酵母样品按所建立的方法进行了测定，结果见表3。标样及样品图见图2、图3。

表4 样品中硒蛋氨酸检测结果Table 4 Determination results of selenomethionine in selenium－enriched yeast

图2 硒蛋氨酸标样及内标的多离子监测色谱图Figure 2 Chromatogram of selenomethionine and internal standard with multiple ions reaction monitoring mode

图3 富硒酵母中硒蛋氨酸及内标的多离子监测色谱图Figure 3 Chromatogram of selenomethionine and internal standard with multiple ions reaction monitoring mode in selenium－enriched yeast

3 结论

比较了富硒酵母中硒蛋氨酸的样品提取方法，优化了酶解法提取富硒酵母中硒蛋氨酸的试验条件，确定的酶解法处理较简便，对于酵母中的硒蛋氨酸提取效率高，损失小；本试验建立的硒蛋氨酸的GC－MS/MS分析方法，样品衍生简单快捷、定量准确、重复性较好，灵敏度高，可以作为富硒酵母中硒蛋氨酸测定的一种新的实用可靠的定性定量手段。

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Determination of selenomethionine in selenium－enriched yeast by gas chromatography－tandem quadrupole mass spectrometry

CHEN Shang－wei DAI Jun WU Sheng－fang YU Rui－pengZHU Song

（Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi，Jiangsu214122，China）

To establish the method of gas chromatography－tandem quadrupole mass spectrometry in order to determine selenomethionine.Three extraction methods were compared for extraction efficiency of selenomethionine from the samples.The extraction conditions of selenomethionine were optimized.The selenomethionine and internal standard（2－chloro－phenylalanine）was derivatives with ethyl chloroformate.The samples were analyzed by GC－MS/MS with internal standard method.Results：The detection limits of selenomethionine were 4ug/L.The recoveries of selenomethionine ranged from 90.0%to 97.0%with RSDs of less than 7.8%.The results obtained indicated that the method was simple，rapid and accurate，and was suitable for the qualitative and quantitative analysis of selenomethionine in selenium－enriched yeast.

selenium－enriched yeast；selenomethionine；tandem quadrupole mass spectrometry

10.3969/j.issn.1003－5788.2012.02.015

陈尚卫（1978－），男，江南大学工程师，工程硕士。E－mail：chenshangwei＠yahoo.com.cn

2011－12－25