Cu和丹皮酚磺酸钠处理对凤丹根系生长、丹皮酚含量及H+-ATPase活性的影响

刘雁丽，史 萍，夏 妍，王桂萍，陈亚华

（南京农业大学生命科学学院，江苏 南京 210095）

丹皮为药用牡丹（Paeonia suffruticosa Andr.）的干燥根皮，具有良好的药用价值。凤丹（P.suffruticosa‘Feng Dan’）是著名的药用牡丹品种，产于安徽，亦称瑶丹、西山丹或安徽丹，安徽铜陵凤凰山的产品质量最佳，即“凤丹皮”，被奉为道地药材。近年来，凤丹被大量引种到各地，虽然凤丹在不同区域的生长状况相似，但生物活性成分差异很大［1］。丹皮酚是丹皮中主要的药效成分，在土壤Cu污染严重的地区（如凤凰山1号尾矿区）出产的丹皮中丹皮酚的含量甚至高于非污染地区［2］。Cu是重金属元素，也是植物必需的微量元素之一，但Cu过量将会对植物产生极大的毒害作用，不仅抑制植物的生长、影响植物对其他营养元素的吸收以及植物的光合作用和呼吸作用，而且破坏细胞的膜系统和酶代谢，使植物的遗传效应发生变化［3］。

据文献报道［4-8］，丹皮酚可以降低膜透性，对氧自由基有直接清除作用；对脂质过氧化反应和低密度脂蛋白氧化修饰具有抑制作用，可以增强抗氧化物酶的活性，显著降低NO含量和NOS活性；丹皮酚还具有类似于钙通道阻遏剂的作用，可抑制细胞Ca2+内流，保护Ca2+-ATPase活性及抗自由基氧化的作用。质膜 H+-ATPase是植物生命活动过程中的主宰酶［9-10］，环境因子作用下植物质膜H+-ATPase的活性变化及其调节在一定程度上能反映环境因子对植物造成伤害的原因，对揭示植物的抗逆机制有重要意义［11-13］，而Al和Cu等重金属胁迫能减弱植物质膜的H+-ATPase活性［14-15］。

为了解Cu胁迫对凤丹幼苗根系生长、丹皮酚含量的影响以及丹皮酚对Cu胁迫的作用，作者在Cu单一处理及Cu-丹皮酚磺酸钠（SPS）复合处理条件下对凤丹根长、丹皮酚含量及Cu含量进行了分析；并采用不连续密度梯度离心法提取凤丹根细胞质膜和液泡膜微囊，研究了Cu和丹皮酚磺酸钠处理对凤丹根质膜和液泡膜H+-ATPase活性的影响，了解丹皮酚对Cu胁迫的缓解作用，以期为中药凤丹的生产以及丹皮酚生理活性的研究提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

供试凤丹种子由安徽铜陵新桥高科技农业示范园提供，经南京农业大学中药材研究所徐迎春教授鉴定。凤丹种子经质量体积分数0.1％的高锰酸钾消毒后，按照体积比1∶3的比例与灭菌的黄沙混合，置于25℃培养箱中层积约30 d，待种子露白后转移至4℃冰箱中低温培养约40 d后供试。

1.2 幼苗胁迫处理及根长、Cu和丹皮酚含量测定方法

1.2.1 胁迫处理方法 挑选生长一致的凤丹幼苗移入带孔盖板的塑料烧杯中，每杯4株；用Hoagland营养液（pH5.5）预培养，每3天更换1次营养液，2周后进行胁迫处理。共设置2组胁迫处理实验，处理时间均为28 d，处理液均用Hoagland营养液（pH5.5）配制，其中Cu均以CuSO4的形式加入，每个处理设置3次重复，每3天更换1次处理液。预培养及胁迫处理期间保持全天通气，白天气温22℃ ～28℃，夜间气温10℃～20℃。

1.2.1.1 Cu胁迫对幼苗根长及根中Cu和丹皮酚含量的影响实验 设置5组处理：0（CK）、5、10、20和30μmol·L-1Cu，其中对照（0μmol·L-1Cu）为不添加CuSO4的Hoagland营养液。分别于处理的第7天、第14天、第21天和第28天测量根系长度；分别于处理的第14天和第28天取样测定Cu和丹皮酚含量。

1.2.1.2 Cu单一和Cu与EGTA或SPS复合处理对根中Cu和丹皮酚含量的影响实验 共设置4组处理：0μmol·L-1Cu（CK）、10μmol·L-1Cu、10 μmol·L-1Cu-10μmol·L-1EGTA、10μmol·L-1Cu-10μmol·L-1SPS（丹皮酚磺酸钠，sodium paeonol sulfonate），其中对照（0μmol·L-1Cu）为不添加CuSO4的Hoagland营养液。分别于处理的第14天和第28天取样测定Cu和丹皮酚含量。

1.2.2 根长测定方法 用直尺测量各处理每株幼苗主根的长度。

1.2.3 Cu和丹皮酚含量测定方法 将凤丹幼苗根部剪下，用自来水冲洗3遍、去离子水冲洗1遍，吸干水分后置于80℃烘箱干燥，冷却后研磨成粉末。精确称取烘干的凤丹根系样品粉末0.2000 g，采用硝酸-高氯酸法［16］消解；用Jena AAS nov AA400火焰-原子吸收分光光度计（德国耶拿分析仪器股份公司）测定Cu含量，并采用国际标准样品（西红柿叶片： SRM1573a，美国国家标准技术研究所）进行质量控制，Cu回收率为93％～104％。

凤丹幼苗根于40℃～50℃条件下烘干后，用玛瑙研钵磨碎，过40目筛；参照文献［17］的方法测定丹皮酚含量。

1.3 离体胁迫处理和膜微囊H+－ATPase活性测定方法

1.3.1 膜微囊制备和纯化及纯度检测 随机收集幼苗幼嫩的侧根根尖组织，消毒后，用预冷（4℃）的去离子水冲洗3次，吸干表面水分后称取50.00 g，参照姚秋菊等［18］的方法，用不连续密度梯度离心法提取根细胞质膜和液泡膜微囊，经纯度检测后用于离体胁迫处理。

参照Yan等［19］的方法检测膜微囊纯度。反应液总体积0.5 mL，含2.5 mmol·L-1ATP、5 mmol·L-1MgSO4、100 mmol·L-1KCl和25 mmol·L-1Hepes-Tris（pH6.5）。在反应体系中分别加入质膜 H+-ATPase抑制剂Na3VO4（0.5 mmol·L-1）、液泡膜H+-ATPase抑制剂KNO3（50 mmol·L-1）、线粒体ATP水解酶抑制剂NaN3（1 mmol·L-1）和非特异性磷酸酶抑制剂Na2MoO4（1 mmol·L-1），根据不同抑制剂的敏感活性在总活性（不加抑制剂）中所占的比例换算膜微囊纯度。所有测定实验均重复3次。

1.3.2 膜微囊的离体处理方法 共设置3组处理：0（CK）、5、10和20μmol·L-1Cu单一处理；0（CK）、0.1、0.2、0.5和1.0μmol·L-1SPS单一处理；10 μmol·L-1Cu-0μmol·L-1SPS、10μmol·L-1Cu-0.1 μmol·L-1SPS、10μmol·L-1Cu-0.2μmol·L-1SPS和10μmol·L-1Cu-0.5μmol·L-1SPS复合处理。其中，对照（0μmol·L-1Cu和0μmol·L-1SPS）为不添加CuSO4或SPS的Hoagland营养液。用各处理液对膜微囊制剂进行处理，3 d后取样测定质膜和液泡膜微囊的H+-ATPase活性。每处理设置3次重复。

1.3.3 H+-ATPase活性测定 参照Cheng等［20］的方法测定质膜H+-ATPase活性；参照何龙飞等［21］的方法测定液泡膜H+-ATPase活性。每次测定设3次重复，重复测定2～3次。

1.4 数据分析

采用SPSS13.0软件对实验数据进行相关性分析和方差分析（P=0.05）。

2 结果和分析

2.1 Cu处理对凤丹幼苗根长及根系中Cu和丹皮酚含量的影响

2.1.1 对根长的影响 用不同浓度Cu处理不同时间凤丹幼苗根长的变化见表1。由表1可以看出：用5μmol·L-1Cu处理7～28 d，对凤丹幼苗的根长略有促进作用，但与对照的差异均不显著（P＞0.05）。用30μmol·L-1Cu处理7～28 d，凤丹幼苗根长均最短，且根长均显著小于对照（P＜0.05）；而用10或20 μmol·L-1Cu处理21～28 d，凤丹幼苗根长总体上显著低于对照。总体上看，随Cu处理浓度的提高，凤丹幼苗根长逐渐减小；而随处理时间的延长，幼苗根长逐渐增加，但低浓度处理组增加幅度大于高浓度处理组。

2.1.2 对根中Cu和丹皮酚含量的影响 根系是受重金属影响最主要的部位，也是最敏感的部位。用不同浓度Cu处理不同时间凤丹幼苗根中Cu和丹皮酚含量的变化见表2。由表2可见：随着Cu浓度的提高和处理时间的延长，凤丹幼苗根系中Cu含量呈增加趋势，各处理组的Cu含量均显著高于对照，且各处理组间也有明显差异。

随Cu处理浓度的提高，处理14和28 d时幼苗根系中丹皮酚含量均呈低浓度条件下高于对照、高浓度条件下显著低于对照的趋势。经5μmol·L-1Cu处理28 d，凤丹幼苗根系中丹皮酚含量显著高于对照；在Cu处理浓度大于5μmol·L-1的条件下，凤丹幼苗根系中丹皮酚含量显著降低，且随Cu处理浓度提高降低幅度增大。经0～20μmol·L-1Cu处理28 d，幼苗根系中丹皮酚含量均高于处理14 d；而用30μmol·L-1Cu处理28 d，幼苗根系中丹皮酚含量低于处理14 d。

表1 不同浓度Cu处理对凤丹幼苗根长的影响（±SE）1）Table1 Effect of Cu treatment with different concentrations on root length of Paeonia suffruticosa‘Feng Dan’seed ling（±SE）1）

表1 不同浓度Cu处理对凤丹幼苗根长的影响（±SE）1）Table1 Effect of Cu treatment with different concentrations on root length of Paeonia suffruticosa‘Feng Dan’seed ling（±SE）1）

1）同列中不同的小写字母表示差异显著（P=0.05）Different small letters in the same column indicate the significant difference（P=0.05）.

Cu浓度/μmol·L-1 Conc. of Cu不同处理时间的根长/cm Root length at different treatment times7d 14 d 21 d 28 d0（CK）9.40±0.53a 11.83±1.35a 15.77±0.56ab 21.90±1.87a59.67±0.88a 12.50±1.06a 16.53±2.35a 22.20±1.72a10 9.73±1.25a 12.01±1.21a 14.57±1.75ab 18.13±2.48b20 8.90±0.85ab 10.70±1.30ab 13.10±2.15b 16.23±1.50b30 8.70±1.00b 10.00±1.20b 11.33±1.65c 12.50±1.86c

表2 不同浓度Cu处理对凤丹幼苗根中Cu和丹皮酚含量的影响（±SE）1）Table2 Effect of Cu treatment with different concentrations on contents of Cu and paeonol in root of Paeonia suffruticosa‘Feng Dan’seed ling（±SE）1）

表2 不同浓度Cu处理对凤丹幼苗根中Cu和丹皮酚含量的影响（±SE）1）Table2 Effect of Cu treatment with different concentrations on contents of Cu and paeonol in root of Paeonia suffruticosa‘Feng Dan’seed ling（±SE）1）

1）同列中不同的小写字母表示差异显著（P=0.05）Different small letters in the same column indicate the significant difference（P=0.05）.

Cu浓度/μmol·L-1 Conc. of Cu不同处理时间的Cu含量/mg·kg-1 Cu content at different treatment times14 d 28 d不同处理时间的丹皮酚含量/g·kg-1 Paeonol content at different treatment times14 d 28 d0（CK）20.02±1.11e 20.55±2.81e 0.34±0.05a 0.36±0.02b5485.57±48.43d 840.12±21.23d 0.39±0.01a 0.41±0.01a10 912.87±36.92c 1594.76±90.54c 0.25±0.01b 0.28±0.00c20 1395.76±46.21b 2099.23±42.14b 0.22±0.01b 0.23±0.02d30 1900.82±71.78a 2937.27±114.24a 0.21±0.01b 0.19±0.01e

2.2 Cu与EGTA或SPS复合处理对凤丹幼苗根系中Cu 和丹皮酚含量的影响

经Cu-EGTA和Cu-丹皮酚磺酸钠（SPS）复合处理14和28 d后凤丹幼苗根系中Cu和丹皮酚含量的变化见表3。由表3可见：经10μmol·L-1Cu处理14和28 d后，幼苗根系中Cu含量均显著高于对照。与之相比，用10μmol·L-1Cu-10μmol·L-1EGTA和10μmol·L-1Cu-10μmol·L-1SPS处理14和28 d后，幼苗根系中的 Cu含量均显著降低。其中，10 μmol·L-1Cu-10μmol·L-1EGTA处理组根系中的Cu含量与对照无显著差异；而10μmol·L-1Cu-10 μmol·L-1SPS处理组根系中的Cu含量则显著高于对照。此外，随处理时间延长，不同处理组丹凤幼苗根系中的Cu含量增加。

由表3还可见：用10μmol·L-1Cu处理14和28 d，凤丹幼苗根系中丹皮酚含量均显著低于对照。与之相比，用10μmol·L-1Cu-10μmol·L-1EGTA和10μmol·L-1Cu-10μmol·L-1SPS处理14和28 d后，凤丹幼苗根系中的丹皮酚含量显著增加。其中，10μmol·L-1Cu-10μmol·L-1EGTA处理组根系中的丹皮酚含量与对照无显著差异；而10μmol·L-1Cu-10μmol·L-1SPS处理组根系中的丹皮酚含量均显著高于对照。此外，随处理时间延长，不同处理组凤丹幼苗根系中丹皮酚呈增高趋势。

2.3 Cu和SPS单一或复合处理对凤丹幼苗根离体质膜和液泡膜微囊H+－ATPase活性的影响

2.3.1 膜微囊纯度检测结果 膜微囊的纯度以H+-ATPase专一性抑制剂对其活性抑制的强弱来判断。质膜、液泡膜和线粒体膜上H+-ATPase的专一性抑制剂分别为Na3VO4、KNO3和NaN3。检测结果表明：凤丹幼苗根质膜微囊H+-ATPase活性被Na3VO4抑制了67％，而分别被KNO3和NaN3抑制了2.1％和1.7％；液泡膜微囊H+-ATPase活性被KNO3抑制了72％，而分别被Na3VO4和NaN3抑制了2.5％和1.5％。符合H+-ATPase活性测定的要求。

表3 Cu与EGTA或丹皮酚磺酸钠（SPS）复合处理对凤丹幼苗根系中Cu和丹皮酚含量的影响（±SE）1）Table3 Effect of comp lex treatment of Cu with EGTA or sodium paeonol sulfonate（SPS）on contents of Cu and paeonol in root of Paeonia suffruticosa‘Feng Dan’seedling（±SE）1）

表3 Cu与EGTA或丹皮酚磺酸钠（SPS）复合处理对凤丹幼苗根系中Cu和丹皮酚含量的影响（±SE）1）Table3 Effect of comp lex treatment of Cu with EGTA or sodium paeonol sulfonate（SPS）on contents of Cu and paeonol in root of Paeonia suffruticosa‘Feng Dan’seedling（±SE）1）

1）同列中不同的小写字母表示差异显著（P=0.05）Different small letters in the same column indicate the significant difference（P=0.05）.

处理Treatment不同处理时间的Cu含量/mg·kg-1 Cu content at different treatment times14 d 28 d不同处理时间的丹皮酚含量/g·kg-1 Paeonol content at different treatment times14 d 28 d0μmol·L-1 Cu（CK）29.89±37.42c 28.23±41.97c 0.31±0.01b 0.34±0.01b10μmol·L-1Cu 922.35±80.12a 1143.45±73.93a 0.26±0.01c 0.28±0.01c10μmol·L-1Cu-10μmol·L-1 EGTA 67.33±35.32c 72.45±26.02c 0.31±0.01b 0.33±0.01b10μmol·L-1 Cu-10μmol·L-1 SPS 500.56±82.23b 642.43±50.34b 0.35±0.01a 0.39±0.01a

2.3.2 Cu单一处理对膜微囊H+-ATPase活性的影响 经不同浓度Cu处理3 d后凤丹幼苗根离体质膜和液泡膜微囊H+-ATPase的活性见表4。由表4可见：与对照相比，经5、10和20μmol·L-1Cu处理后凤丹根质膜和液泡膜微囊H+-ATPase活性降低，且随Cu浓度的提高，对膜微囊H+-ATPase活性的抑制效应越明显。经5、10和20μmol·L-1Cu处理，凤丹幼苗根质膜微囊H+-ATPase活性分别下降至对照的93.3％、82.1％和74.3％；而液泡膜微囊H+-ATPase活性分别下降至对照的96.5％、93.2％和69.9％。

表4 Cu单一处理对凤丹幼苗根离体质膜和液泡膜微囊H+－ATPase活性的影响（±SE）1）Table4 Effect of Cu single treatment on H+-ATPase activity of m icrocapsules in vitro of plasma membrane and tonoplast in root of Paeonia suffruticosa‘Feng Dan’seedling（±SE）1）

表4 Cu单一处理对凤丹幼苗根离体质膜和液泡膜微囊H+－ATPase活性的影响（±SE）1）Table4 Effect of Cu single treatment on H+-ATPase activity of m icrocapsules in vitro of plasma membrane and tonoplast in root of Paeonia suffruticosa‘Feng Dan’seedling（±SE）1）

1）同列中不同的小写字母表示差异显著（P=0.05）Different small letters in the same column indicate the significant difference（P=0.05）.

Cu浓度/μmol·L-1 Conc. of Cu微囊H+-ATPase活性/μmol·mg-1·h-1 H+-ATPase activity in microcapsules质膜Plasmamembrane 液泡膜Tonoplast0（CK）26.08±2.03a 23.99±1.59a524.32±1.71ab 23.15±1.68ab10 21.41±1.12b 22.37±1.91ab20 19.39±1.01b 16.78±2.58b

2.3.3 SPS单一处理对膜微囊H+-ATPase活性的影响 经不同浓度SPS处理3 d后凤丹幼苗根质膜和液泡膜微囊H+-ATPase的活性见表5。由表5可见：与对照相比，经0.1、0.2、0.5和1.0μmol·L-1SPS处理后幼苗根系质膜和液泡膜微囊H+-ATPase活性或略增加或略降低，但差异均不显著；总体上看，随SPS浓度的增加，膜微囊H+-ATPase活性逐渐增加，其中，1.0μmol·L-1SPS处理组膜微囊H+-ATPase活性最高。

表5 丹皮酚磺酸钠（SPS）单一处理对凤丹幼苗根离体质膜和液泡膜微囊H+－ATPase活性的影响（±SE）1）Table5 Effect of sodium paeonol sulfonate（SPS）single treatment on H+-ATPase activity of m icrocapsules in vitro of p lasma membrane and tonoplast in root of Paeonia suffruticosa‘Feng Dan’seedling（± SE）1）

表5 丹皮酚磺酸钠（SPS）单一处理对凤丹幼苗根离体质膜和液泡膜微囊H+－ATPase活性的影响（±SE）1）Table5 Effect of sodium paeonol sulfonate（SPS）single treatment on H+-ATPase activity of m icrocapsules in vitro of p lasma membrane and tonoplast in root of Paeonia suffruticosa‘Feng Dan’seedling（± SE）1）

1）同列中不同的小写字母表示差异显著（P=0.05）Different small letters in the same column indicate the significant difference（P=0.05）.

SPS浓度/μmol·L-1 Conc. of SPS微囊H+-ATPase活性/μmol·mg-1·h-1 H+-ATPase activity in microcapsules质膜Plasmamembrane 液泡膜Tonoplast0.0（CK）26.33±1.61a 23.99±1.61a0.1 26.48±1.79a 23.58±1.71a0.2 26.03±1.73a 23.83±1.61a0.5 27.00±2.23a 24.25±2.06a1.0 30.29±2.01a 24.89±1.45a

2.3.4 Cu-SPS复合处理对膜微囊H+-ATPase活性的影响 经Cu-SPS复合处理3 d后凤丹幼苗根质膜和液泡膜微囊H+-ATPase活性见表6。由表6可见：与不添加SPS的10μmol·L-1Cu处理组（对照）相比，10μmol·L-1Cu与0.1、0.2和0.5μmol·L-1SPS复合处理使凤丹幼苗根质膜微囊H+-ATPase活性分别提高了3.4％、16.2％和27.3％，且10μmol·L-1Cu-0.5μmol·L-1SPS复合处理组的质膜微囊H+-ATPase活性显著高于对照；而10μmol·L-1Cu与0.2和0.5μmol·L-1SPS复合处理组的液泡膜微囊H+-ATPase活性有所增加，但与对照差异不显著。

上述结果说明：在10μmol·L-1Cu胁迫条件下添加0.1～0.5μmol·L-1SPS总体上可以提高凤丹幼苗根系膜微囊H+-ATPase活性，且对质膜微囊H+-ATPase的保护作用大于对液泡膜微囊H+-ATPase的保护作用。

表6 Cu－丹皮酚磺酸钠（SPS）复合处理对凤丹幼苗根离体质膜和液泡膜微囊H+－ATPase活性的影响（±SE）1）Table6 Effect of complex treatment of Cu with sodium paeonol sulfonate（SPS）on H+-ATPase activity in m icrocapsules in vitro of plasmamembrane and tonoplast in root of Paeonia suffruticosa‘Feng Dan’seedling（±SE）1）

表6 Cu－丹皮酚磺酸钠（SPS）复合处理对凤丹幼苗根离体质膜和液泡膜微囊H+－ATPase活性的影响（±SE）1）Table6 Effect of complex treatment of Cu with sodium paeonol sulfonate（SPS）on H+-ATPase activity in m icrocapsules in vitro of plasmamembrane and tonoplast in root of Paeonia suffruticosa‘Feng Dan’seedling（±SE）1）

1）同列中不同的小写字母表示差异显著（P=0.05）Different small letters in the same column indicate the significant difference（P=0.05）.

浓度/μmol·L-1 Concentration Cu SPS微囊H+-ATPase活性/μmol·mg-1·h-1 H+-ATPase activity in microcapsules质膜Plasmamembrane 液泡膜Tonoplast10 0.0 21.45±1.11b 22.36±1.63a10 0.1 22.15±1.32ab 21.87±0.97a10 0.2 24.88±1.79ab 23.72±2.15a10 0.5 27.21±1.88a 26.79±2.15a

3 讨论和结论

在重金属胁迫条件下，根长可以作为评价植物对重金属耐性的间接指标［22］。当培养液中重金属元素的浓度大于4μmol·L-1时，双穗雀稗（Paspalum distichum L.）和狗牙根〔Cynodon dactylon（L.）Pers.〕的根系生长受到显著抑制［23］。但适当浓度的重金属可以促进植物的生长：低浓度Cu（10μmol·L-1）可以刺激向日葵（Helianthus annuus L.）幼苗茎叶脯氨酸的合成并促进其营养生长［24］；用50和100μmol·L-1Cu处理可促进 Cu超积累植物海州香薷（Elsholtzia splendens Nakaiex F.Maekawa）的生长，并能增加根系的伸长量和植株的干质量［25］。本研究结果显示：用5μmol·L-1Cu进行处理，对凤丹幼苗的根长没有明显影响；但Cu处理浓度大于5μmol·L-1，对凤丹幼苗的根长有抑制作用，且浓度越高抑制作用越明显。

席玉英等［26］对矮牡丹（Paeonia suffruticosa Andr.var.spontanea Rehd.）体内无机元素的分布规律进行了研究，认为矮牡丹对必需元素Cu有较强的吸收富集能力。沈章军等［27］对安徽铜陵凤凰山铜尾矿牡丹种植基地土壤和牡丹中重金属污染状况进行了分析，结果表明：在牡丹种植地的土壤中，Cu含量与牡丹根皮中的Cu含量呈正相关，丹皮内的Cu含量与丹龄之间的相关系数为0.842。本实验结果表明：低浓度Cu（5μmol·L-1）处理可以使凤丹幼苗根系中丹皮酚含量增加，随着处理时间的延长增加效果不变；而高浓度Cu（高于或等于10μmol·L-1）处理对丹皮酚的积累具有抑制效应。

EDTA和EGTA是最常用的、也是目前研究较多的螯合剂，与重金属均具有很强的结合能力。传统理论认为：植物对金属离子的吸收主要取决于溶液中该离子游离态的活度大小［28］。在离子-螯合剂混合溶液中，只有自由离子才能被根系吸收，当EDTA将重金属离子由离子态转变为螯合态时，自由离子活度下降，植物对重金属的吸收减少，从而能够缓解重金属的生物毒性［29］。本实验结果显示：与Cu单一胁迫处理相比，添加EGTA的复合处理可使凤丹幼苗根系中Cu含量显著降低，也证实了EGTA对Cu毒害具有一定的缓解作用。

酚类物质在提高植物抵御重金属胁迫的能力中具有重要作用［30］，可以通过与Cu等重金属离子的结合降低重金属对植物的胁迫作用［31］。Xu等［32-33］和Sillanpää［34］的体外合成实验结果表明：丹皮酚可以与Cu（Ⅱ）离子形成复合物。本实验结果表明：分别加入与Cu处理浓度相同的 EGTA或丹皮酚磺酸钠（SPS），可以显著降低凤丹幼苗根系中的Cu含量，但SPS的降低效果较EGTA差。在溶液中丹皮酚可能与Cu结合，但结合能力低于EGTA，且形成的结合物不易被凤丹幼苗根系吸收，从而使凤丹幼苗根系中Cu含量降低。

质膜H+-ATPase是质膜上一种重要的功能蛋白，在植物细胞的物质转运、生长发育等方面具有重要作用，逆境胁迫往往导致植物细胞膜H+-ATPase活性的改变［11，13］。杨颖丽等［15］直接用 CuSO4处理小麦（Triticum aestivum L.）后检测质膜微囊H+-ATPase的活性变化，结果表明：50、100和200μmol·L-1CuSO4能够抑制小麦质膜H+-ATPase的活性，其作用具有浓度依赖性。作者检测了Cu胁迫处理后丹凤根离体膜微囊H+-ATPase活性的变化，结果表明：与对照相比，5、10和20μmol·L-1Cu处理均使幼苗根系离体质膜和液泡膜微囊H+-ATPase活性下降，且Cu浓度越高H+-ATPase活性降幅越大，表明5～20μmol·L-1Cu胁迫处理对凤丹幼苗根系质膜与液泡膜微囊 H+-ATPase活性具有抑制作用，且该抑制作用具有浓度依赖性。

丹皮酚可以降低膜透性［4］，且还具有类似于钙通道阻遏剂（异博定）的作用，可抑制细胞Ca2+内流，保护Ca2+-ATPase活性［8］。本实验结果显示：用0.1、0.2、0.5和1.0μmol·L-1的丹皮酚磺酸钠（SPS）处理后，凤丹幼苗根系离体质膜和液泡膜微囊 H+-ATPase活性与对照无显著差异；与10μmol·L-1Cu单一处理相比，添加SPS总体上可以使凤丹幼苗根系离体质膜和液泡膜微囊H+-ATPase活性升高，即SPS可以提高Cu胁迫条件下凤丹幼苗根系离体质膜和液泡膜微囊H+-ATPase活性，对Cu的抑制作用具有缓解作用。

综合上述实验结果可见：随Cu胁迫处理浓度的提高，凤丹根系中的Cu含量显著增加；适当浓度的Cu处理对凤丹幼苗根系生长没有明显影响，还可使根系中丹皮酚含量有所增加；但较高浓度的Cu胁迫处理对凤丹幼苗根系生长有明显的毒害作用，且对根系中丹皮酚的合成有一定的抑制作用，这种毒害和抑制作用具有浓度依赖性；在Cu胁迫条件下添加外源SPS以及EGTA，可以提高凤丹根系中丹皮酚含量，显著降低根系中的Cu含量，对凤丹根系的Cu胁迫伤害具有一定的缓解作用。离体条件下，Cu单一处理对凤丹根系质膜和液泡膜微囊H+-ATPase活性有明显的抑制作用，但SPS单一处理对凤丹根系质膜和液泡膜微囊H+-ATPase活性则有一定的促进作用；而Cu与SPS复合处理也能提高质膜和液泡膜微囊H+-ATPase的活性，说明添加外源丹皮酚磺酸钠对Cu胁迫伤害具有一定的缓解效应，这可能是凤丹耐铜胁迫的机制之一。

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