丝胶对2型糖尿病大鼠肝糖原含量的影响*

张 艳，王 福，乔志燕，梅立新，温海玲，陈志宏△

(1.承德医学院，河北承德 067000;2.承德医学院附属医院)

2型糖尿病是一种遗传和环境因素共同作用形成的多基因遗传性复杂疾病，可直接引起肝脏结构和功能的损伤。肝脏是贮存糖原的重要器官，糖代谢过程中某些酶活性的变化将导致肝糖原的含量发生变化。多数动物实验表明，高血糖动物模型肝脏糖原含量下降，经典降糖西药二甲双胍可通过增加糖原合成等作用降低血糖[1];许多降血糖的中药也可通过增加肝糖原含量发挥降血糖的作用[2]。蚕茧提取物—丝胶是一种由18种氨基酸组成的高分子水溶性蛋白，本课题组的前期研究发现，丝胶能有效降低2型糖尿病大鼠的血糖，并对糖尿病血糖升高具有一定的预防作用[3]。本研究通过观察丝胶对2型糖尿病大鼠肝糖原含量的影响，探讨丝胶降血糖作用的机制及对肝糖原储备的保护作用。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)，购于美国Sigma公司，临时用pH4.4的枸橼酸钠-枸橼酸缓冲液配成2%的溶液。丝胶为彩色蚕茧经浸泡、水煎、过滤、浓缩而成。RM2125 RT切片机，德国Leica公司;BH-2型OLYMPUS显微镜及摄像装置，日本Olympus公司。

1.2 实验动物的分组与处理 清洁级雄性SD大鼠60只，由河北医科大学实验动物中心提供(合格证号:712024)，体重200-250g。将大鼠随机分为5组:正常对照组、糖尿病模型组、丝胶治疗组、阳性对照组、丝胶预防组，每组12只。模型组、丝胶治疗组、阳性对照组大鼠均采用2% STZ(25mg/kg，3d)连续腹腔注射建立糖尿病动物模型，一周后以血糖≥16.7mmol/L作为成模标准。待模型成功建立后，模型组大鼠不做任何处理;丝胶治疗组大鼠给予丝胶(2.4g/kg/d)连续灌胃35d;阳性对照组大鼠给予二甲双胍(55.33mg/kg/d)连续灌胃，时间同丝胶治疗组。丝胶预防组大鼠于连续注射STZ(25mg/kg)前给予丝胶(2.4g/kg/d)灌胃35d。

1.3 检测血糖 各组大鼠禁食12h以上，4%水合氯醛腹腔注射，成功麻醉后，经内眦于眶后静脉丛采血，京立LD4-2A离心机3000r/min离心20min，收集血清，应用日立公司全自动临床生化分析仪采用葡萄糖氧化酶法检测血糖。

1.4 肝糖原含量的检测及定量分析 大鼠取血后断头处死，取肝脏，置于Bouins液固定，常规石蜡包埋。Leica石蜡切片机连续切片，片厚5μm，行过碘酸雪夫染色(periodic acid-schiff stain，PAS)染色。切片脱蜡后，入95%乙醇60min，1%过碘酸氧化液40μl染色5-10min;蒸馏水洗后滴加Schiff试剂20μl，染色10-15min;弃掉玻片上多余的Schiff试剂后，滴加0.5%偏重亚硫酸钠50μl，连续3次，每次间隔1-2min;流水冲洗后苏木素复染细胞核，常规脱水、透明、封片。阴性对照采用淀粉酶消化处理组织切片;以胞浆出现紫红色颗粒为阳性结果。采用MiVnt图像分析系统对PAS染色阳性结果进行定量分析:每组随机选取6只大鼠，每只大鼠选取10张肝组织切片，每张切片在10×40倍显微镜下选取视野，计算阳性产物面积占视野面积的比值，取平均值作为肝糖原含量的相对水平。

2 结果

2.1 丝胶对2型糖尿病大鼠血糖的影响 模型组大鼠的血糖水平明显高于正常对照组大鼠(P＜0.01);丝胶治疗组、阳性对照组、丝胶预防组大鼠的血糖水平均明显低于糖尿病模型组大鼠(P＜0.01);且丝胶治疗组、丝胶预防组与阳性对照组比较无明显差别(P＞0.05)。见附表。结果表明，丝胶可明显降低糖尿病模型大鼠的血糖水平。

2.2 丝胶对2型糖尿病大鼠肝糖原含量的影响 各组大鼠肝脏切片均可见PAS法肝糖原阳性产物，为紫红色颗粒或细腻颗粒片状聚集，位于肝细胞胞浆。糖尿病模型组大鼠肝糖原的含量明显低于正常对照组大鼠(P＜0.01);丝胶治疗组、阳性对照组、丝胶预防组大鼠肝糖原的含量均明显高于糖尿病模型组大鼠(P＜0.01)，且丝胶治疗组、丝胶预防组与阳性对照组比较无明显差别(P＞0.05)。见附表。结果表明，丝胶可明显增加2型糖尿病大鼠肝糖原的含量。

附表 各组大鼠的血糖和肝糖原含量(±s，n=12)

附表 各组大鼠的血糖和肝糖原含量(±s，n=12)

与糖尿病模型组比较:*P＜0.01;与阳性对照组比较:#P＞0.05

组别 血糖(mmol/L)肝糖原(面积百分比)正常对照组 10.83±2.03* 24.33±1.73*糖尿病模型组 29.45±4.82 12.21±2.27丝胶治疗组 13.20±4.09*# 21.26±1.62*#阳性对照组 13.18±2.30* 21.18±1.39*丝胶预防组 10.04±2.29*# 23.81 ±2.71*#

3 讨论

高血糖作为糖尿病的基本病理特征，也是引起慢性并发症的重要原因，严格控制糖尿病患者的血糖水平，是避免引起糖尿病并发症的关键。肝脏可通过促进糖原合成、葡萄糖利用及抑制糖异生等途径降低血糖，是糖代谢的主要器官。肝脏的糖代谢作用主要在胰岛素的诱导下完成，胰岛素能够抑制内源性葡萄糖的产生以及刺激外周组织摄取葡萄糖，通过激活糖原合成酶磷酸酶，使糖原合成酶去磷酸化，从而提高糖原合成酶的活性，促进糖原的合成[4-6]。糖尿病时，胰岛素对葡萄糖的氧化和非氧化作用的刺激均受损，其中非氧化受损明显，肝糖原合成作为葡萄糖非氧化代谢的重要组成部分受到显著影响[7]。四氧嘧啶糖尿病模型小鼠胰岛素水平明显降低，肝脏糖代谢紊乱，糖原合成降低、葡萄糖利用减少、糖异生加强，导致血糖升高[8-9]。本研究亦证实了这一点，糖尿病模型组大鼠肝糖原明显减少，提示糖尿病大鼠肝细胞合成糖原的功能可能由于胰岛素作用的减弱而受到损伤。

本研究发现，丝胶可显著降低糖尿病模型大鼠的血糖水平，增加肝脏肝糖原的含量，表明丝胶可通过增加肝糖原的合成改善机体的高血糖状态，其作用效果与阳性药物二甲双胍接近。由此推测，增加肝糖原含量可能是丝胶降血糖作用的机制之一，但增加肝糖原含量可能不是丝胶降血糖作用的唯一机制。因此，要全面了解丝胶降血糖的作用机制，还有待进一步研究。

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