丝胶对丝素/丝胶共混材料结构和性能的影响

孙笑笑，程志玲，王 颖，李明忠

(苏州大学纺织与服装工程学院，江苏 苏州 215021)

家蚕丝是由约75%的丝素蛋白、25%的丝胶蛋白以及1%～5%的蜡质、脂肪、无机物及色素组成。丝胶蛋白包裹在两根丝素单丝的外围，具有黏合与保护作用[1]。丝素蛋白由20种氨基酸组成，其中甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸三种中性氨基酸的合计占80%以上。丝素蛋白主要组分的H-链的核心区域中，大部分氨基酸序列以“-甘氨酸-X-”(X中65%为丙氨酸、23%为丝氨酸、9%为酪氨酸)的规律重复出现，链段间平行排列，并依靠氢键紧密结合，形成反平行β-折叠构象，进而形成silk II结晶结构。具备这种结构的丝素材料强度高，生物降解速度慢，且具有较强的热力学稳定性[2]。丝素蛋白中的silk I结晶结构是由α-型分子构象的丝素蛋白链段堆积而成的亚稳态结构[3]。经湿热、应力作用、极性溶剂等处理后，silk I可以向silk II转变[4]。与丝素蛋白不同，组成丝胶蛋白的主要氨基酸是丝氨酸、天门冬氨酸、甘氨酸及苏氨酸等，这四种氨基酸的合计占70%以上[5]。大部分氨基酸侧链带有羧基、羟基等极性基团，因此丝胶表现出较强的亲水性及化学反应活性[6]。丝胶是复合蛋白，分子量分布于24～400 kDa，二级结构主要是无规卷曲结构[7]，难以形成结晶结构，故以纯丝胶制成的材料结构欠稳定，强度较低且易被生物降解[8]。

用丝胶与丝素共混是调节丝蛋白材料的凝聚态结构、微观形态结构、理化性能及生物学性能的途径之一。将天然蚕丝中的丝胶和丝素蛋白分别溶解和纯化后，采用浇铸、冷冻干燥、湿法纺丝、高压静电纺丝、脱水等材料成形技术，可制备出丝素/丝胶共混薄膜、三维多孔材料、纤维、凝胶、颗粒等多种形态的丝蛋白材料，用于创面修复、组织引导、手术缝合、药物控制释放等生物医学领域[9-11]。丝胶所占比例对丝蛋白材料的凝聚态结构、微观形貌、力学性能、水溶性以及生物降解速度、细胞相容性等生物学性能均有不同程度的影响。

1 丝胶对丝素/丝胶共混膜结构和性能的影响

丝素/丝胶共混膜中丝胶所占比例对膜的聚集态结构有明显影响。将蚕茧置于质量分数0.2%的碳酸钠和质量分数0.3%的马赛皂的混合溶液中沸煮1 h脱胶后，在LiBr溶液中溶解并经透析后获得丝素蛋白溶液。茧壳在120℃水中处理1 h，过滤获得丝胶蛋白溶液。将质量分数为1%的丝素和丝胶溶液以75∶25的比例混合，流延法80℃干燥成膜，最后用甲醇处理制得丝素/丝胶共混膜，经相同程序制得的纯丝素膜作为对照组。差示扫描量热法测试结果显示，纯丝素膜经甲醇处理后，原220℃处的热吸收峰和177℃处的玻璃化转变消失，表明丝素结构由silk I向silk II转变，而丝素/丝胶共混膜在这两处的吸热-放热变化仍能观察到。X-射线衍射测试结果表明，甲醇处理前的丝素膜为无定形结构，甲醇处理后的丝素膜在衍射角20°附近出现强衍射，表明结晶结构的形成；而经甲醇处理前后丝素/丝胶共混膜的X-射线衍射曲线没有显著差异。红外吸收光谱显示纯丝素膜在经甲醇处理78 s后β-折叠结构占优势，而丝素/丝胶共混膜在180 s后才有β-折叠结构形成。以上结果说明丝素/丝胶共混膜中的丝胶组分能延缓丝素β-折叠结构形成，抑制丝素形成结晶结构[2]。

丝素/丝胶共混膜中丝胶所占比例对膜的水溶性及机械性能有明显影响。将茧壳在水中沸煮40 min获得丝胶溶液，在丝胶溶液中添加丝素，用聚乙二醇缩水甘油醚作交联剂制得丝素/丝胶质量比为0/100、10/90、20/80、30/70和40/60的共混膜。随着共混膜中丝胶所占比例的降低，膜的弹性模量有所下降，丝胶比例在90%左右时共混膜断裂强度和弹性较高，弹性形变可达91.6%[12]。

丝素/丝胶共混膜中丝胶所占比例对成纤维细胞在膜表面黏附、增殖的影响，与丝素、丝胶的来源有关。从成熟的家蚕幼虫的后部绢丝腺提取丝素、丝胶蛋白，流延法干燥制膜，并用甲醇处理。研究小鼠成纤细胞L929在再生丝蛋白膜上的黏附和增殖[13]。结果表明，当共混膜中丝胶所占比例为55%或93%时，细胞在膜表面的黏附率及细胞活力低于纯丝素膜或纯丝胶膜。通过用不同浓度的油酸钠和碳酸钠对茧壳脱胶，获得残胶率在0%～16%范围的蚕丝，脱胶程度不同的蚕丝用CaCl2/H2O/EtOH三元溶剂溶解，纯化、干燥后制得含胶率不同的蚕丝蛋白固体，再将蚕丝蛋白固体溶解于980 mg/mL的甲酸溶液中，流延法25℃干燥制膜。成纤维细胞NIH 3T3在膜表面进行体外培养的实验结果表明，细胞增殖活力随着膜内丝胶占比的增多而下降[14]。

以上研究表明，丝胶所占比例对丝素/丝胶共混膜的凝聚态结构、水溶性、机械性能和生物相容性都有不同程度的影响。丝胶能延缓丝素结晶结构的形成，进而影响共混膜的强度、亲水性、水溶性等物理性能。丝胶所占比例对丝素/丝胶共混膜细胞相容性的影响与丝素、丝胶的来源有关。

2 丝胶对丝素/丝胶共混多孔材料结构和性能的影响

用蒸馏水于130℃处理蚕丝30 min得到丝胶蛋白；用0.02 mol/L的Na2CO3溶液将蚕丝脱胶后，用LiBr溶液溶解、透析后获得丝素蛋白。丝胶、丝素蛋白溶液按照质量比0/100,2/98,4/96,6/94,8/92混合后，加入致孔颗粒NaCl，室温存放2 d后用水浸泡去除NaCl，得到共混比例不同的丝胶/丝素多孔材料[15]。电子显微镜观察到丝胶/丝素共混比为6/94和8/92时，多孔材料内孔壁上有大量凸起，这是丝胶与丝素产生相分离的表现。孔径及孔隙率的试验结果表明，随着丝胶所占比例的增大，多孔材料内部的孔径及孔隙率有所增大，材料的压缩回弹性提高。丝胶/丝素共混比为6/94和8/92时多孔材料的压缩回弹率可达100%。

脱胶不充分的蚕丝用作手术缝合线有引起炎症反应的风险[16-17]，研究免疫细胞对丝素/丝胶多孔支架的应答及炎症因子的释放是评估其免疫原性风险的手段之一。将茧壳置于Na2CO3溶液中于90℃处理1 h，溶液经透析、乙醇诱导沉淀、干燥后获得丝胶固体。脱胶茧壳用LiBr溶解，纯化后获得丝素溶液。将丝胶固体溶解于丝素溶液中，经冷冻干燥、戊二醛蒸汽交联后分别得到丝素/丝胶共混比为100/0、75/25、50/50、25/75、0/100的多孔支架。在各支架上接种和培养成骨细胞MG-63进行细胞毒性检测的结果显示，培养1 d和7 d后各实验组之间乳酸脱氢酶释放量无明显差异，显示丝素/丝胶支架中丝胶占比对细胞增殖无明显影响。在不同丝素/丝胶共混比的支架上接种和培养人单核-巨噬细胞THP-1，并使用逆转录-聚合酶链式反应技术和酶联免疫吸附技术分析炎症因子的表达，结果显示培养1 d后各支架组趋化因子CXCL10的表达水平都很低；随着支架中丝胶占比的增大，白细胞相关抗原CD197和肿瘤坏死因子TNF-α的表达水平有所增高，肿瘤坏死因子TNF-α的分泌量有所增多，但TNF-α的分泌量远低于阳性对照组，表明丝胶虽有一定的致炎风险，但不显著[18]。

现有研究表明，随着丝素/丝胶多孔材料中丝胶所占比例的增大，材料内部的孔径、孔隙率、孔壁的粗糙程度增大，压缩弹性增大，部分炎症因子的表达有所增多，但对细胞毒性无显著影响。

3 丝胶对丝素/丝胶共混纤维结构和性能的影响

采用湿法纺丝及高压静电纺丝技术可制备微米或纳米级的丝素/丝胶共混纤维网，应用于皮肤缺损创面时，通常具有促进创面愈合的功能[19-20]。

有研究表明，在用甲酸作为丝素和丝胶的共溶剂进行湿法纺丝的过程中，当丝素/丝胶共混材料中丝胶所占比例较低(丝胶占9.6%)时，丝胶可通过与丝素的物理相互作用帮助丝素蛋白折叠，促进丝素结晶结构的形成，并改善再生丝纤维的力学性能[21]。将丝素、丝胶固体以100/0、90/10和80/20三种质量比溶解在LiBr溶液中，再经纯化、干燥获得丝素/丝胶共混海绵。将共混海绵溶解在98%甲酸中来制备纺丝液，用湿法纺丝技术制备丝素/丝胶共混纤维，并进行1～4倍牵伸。在相同牵伸倍率的条件下，丝胶占比较大者，制得的再生丝纤维的直径较大；经2倍以上牵伸后，含丝胶的再生丝纤维中丝素蛋白大分子的取向度更高，纤维的拉伸强度和断裂伸长率明显高于不含丝胶的纤维[22]。

用静电纺丝技术可以制备丝素/丝胶共混纳米纤维。将丝素、丝胶水溶液按照丝素/丝胶质量比100/0、90/10、85/15和75/25混合后进行高压静电纺丝，对得到的共混丝纤维进行显微拉曼光谱分析、热分析和拉伸性能的测定结果表明，随着丝胶所占比例的增大，α-型结构和无规卷曲结构的特征吸收减弱，β-折叠结构的特征吸收增强，热分解温度增高，拉伸强度提高，断裂伸长率降低[23]。

4 丝胶对丝素/丝胶共混凝胶结构和性能的影响

丝素和丝胶都可自发完成溶胶向凝胶的转变。在凝胶化过程中，丝蛋白大分子之间主要依靠氢键和静电相互作用形成网络结构。水溶液中丝素或丝胶的浓度越高，则凝胶化速度越快[24-25]。丝胶蛋白的溶胶-凝胶转变可逆，而丝素蛋白的溶胶-凝胶转变不可逆。

用Na2CO3和马赛皂的混合溶液将茧壳脱胶后获得丝素纤维；用含2-巯基乙醇的尿素溶液于80℃处理10 min，纯化、干燥后获得丝胶固体。将丝素纤维和丝胶固体分别溶解在9.3 mol/L的LiBr溶液中，经透析后得到的丝素、丝胶溶液按照丝素/丝胶质量比100/0、75/25、50/50、0/100混合，溶液中丝蛋白的总质量分数为4%。在溶液于50℃保温形成凝胶过程中，随着溶液中丝胶所占比例的增大，凝胶化时间明显延长，且观察到的相分离现象更明显。丝素溶液的凝胶化过程伴随着无规卷曲向β-折叠构象的转变，而丝素/丝胶共混溶液中丝胶的存在延缓了向β-折叠的构象转变。红外吸收光谱和X-射线衍射分析表明，共混凝胶中丝胶占比越高，则形成的凝胶内部无规卷曲和β-转角结构有所增多，而β-折叠结构的含量下降，凝胶的水溶性提高，抗压强度和压缩模量有所减小[26]。这说明在浓度较高的丝素/丝胶共混体系中，丝胶具有稳定丝素的α-型结构、阻止其向β-折叠结构转变，进而延缓凝胶化的效应。

5 总结与展望

丝素是纤维状蛋白，而丝胶是球状蛋白，二者的结构、性能存在显著差异。用丝胶与丝素共混是调节丝素材料结构和性能的途径之一。丝素/丝胶共混材料中丝胶所占比例，对材料内丝蛋白的凝聚态结构、微观形态结构及理化性能、生物学性能都产生影响，影响程度与丝素和丝胶的来源、纯化程度和方法、溶剂种类、溶液浓度等因素有关。丝素、丝胶的来源和纯化方法不同，往往产生完全不同的结果，因此有待进一步建立和完善丝素、丝胶的纯化和鉴定技术，在此基础上深入探讨二者在蛋白水平和纳米尺度的相互作用规律，加强对丝胶的生物降解及免疫效应的研究，加快将丝素、丝胶蛋白安全、有效地用于生物医学领域的进程。