虫草多糖的分离纯化及含量测定

崔立勋 张爱华 孙守英

[摘要]目的 采用发酵法从冬虫夏草发酵液及菌丝体中提取、分离虫草多糖。 方法 采用乙醇沉淀法分离冬虫夏草发酵液和菌丝体中的多糖；采用苯酚硫酸法测定样品中多糖含量。 结果 采用此法进行制备、检测，方法简单快速，结果准确，适宜推广使用。结论 此法无需多糖纯品，具有快速简单、精确度高、灵敏度高、重现性较好的优点，是检测虫草多糖含量的较优方法之一。

[关键词]发酵液；虫草多糖；菌丝体虫草多糖；分离纯化；含量测定

[中图分类号] R28???[文献标识码] B???[文章编号] 2095-0616（2012）21-95-02

Purification and determination of Cordyceps polysaccharide

CUI?Lixun1??ZHANG?Aihua1??SUN?Shouying2

1.Heilongjiang Biotechnology Vocational College，Harbin 150025，China；2.Heilongjiang New Yisheng Pharmaceutical Co.，Ltd，Jixi 158200，China

[Abstract] Objective Using the method of inoculated fermentation to extract and separate the Cordyceps polysaccharide from the zymotic fluid and mycelium of Chinese caterpillar fungus. Methods Separated the polysaccharide of Chinese caterpillar fungus' zymotic fluid and mycelium in ethanol precipitation；survey and evaluate the polysaccharide content of samples in phenol-sulfuric acid method. Results It is profitable for using widely because of the fast， easy method and exact result for producing and detecting. Conclusion This method is one of excellent ways for detecting the Cordyceps polysaccharide contents and it doesn't need the polysaccharide from pure product. The advantages are fast and easy， high accuracy and sensitivity，and good reproducibility.

[Key words] Fermentation broth；Cordyceps polysaccharide；Mycelium of Cordyceps polysaccharide； Separation and purification； Content determination

冬虫夏草首载于本草从新，味甘，性温，归肺、肾经，具补肺益肾，止血化痰之功效。冬虫虫草中含量最高的活性物质是虫草多糖，因其可以抗氧化、抗肿瘤和增强免疫力等功效而受广大人群青睐，由于天然的活性成分来源有限，现多采用人工发酵法生产制备。作者用苯酚-硫酸法测定虫草多糖含量。

1?材料

1.1?供试材料

虫草菌株（青海省）；蒸馏水（双蒸水）、发酵液精多糖Ⅰ和菌丝体精多糖Ⅱ；葡萄糖标准溶液（100 μg/mL）等。

1.2?仪器及设备

培养箱（常州市恒久仪器制造有限公司光照培养箱）；高压蒸汽灭菌设备（鸡西辰丰医疗器械制造有限公司YXQ.L-75型立式压力蒸汽灭菌器）；大容量离心机（北京时代北利离心机有限公司GTR10-2）；紫外分光光度计（上海悦丰仪器仪表有限公司）等。

1.3?培养基配方

1.3.1?活化培养基（g/mL）?蔗糖溶液1.30%，葡萄糖溶液1.30%，蛋白胨0.01%，酵母粉0.065%，琼脂0.5%，KH2PO4 0.025%，MgSO4·7H2O 0.012 5%，pH自然，培养温度27℃。

1.3.2?发酵培养基（g/mL）?葡萄糖1.75%，蛋白胨0.02%，酵母粉0.062 5%， KH2PO4 0.025%，MgSO4·7H2O 0.012 5%， pH自然，温度27℃[1]。

2?方法

2.1?配制培养基和灭菌

按体积向培养基中加入蒸馏水，加热煮沸，调节pH值至中性，趁热倒入容器中。高压蒸汽灭菌，温度121.9℃，时间20 min。灭菌完成，趁热倒在平板上。

2.2?活化菌种

在无菌条件下，将冷冻完好的菌种接到培养基上，无光条件下27℃培养，培养菌丝洁白并生长旺盛且无杂菌后备用。

2.3?配制发酵培养基及培养

把培养基上的菌种快速接入到发酵培养基中，在27℃条件下，无光培养192 h。

2.4?发酵液多糖的分离纯化[2]

2.4.1?发酵液及透析袋的处理?发酵液在4 000 r/min条件下离心20 min，过滤得到上清液和沉淀（菌丝体）。将透析袋分成小段后，处理后在4℃条件下存放于冰箱保存待用。

2.4.2?发酵液多糖的提取?醇沉：将无水乙醇以3倍体积加于发酵液中，离心后得上清液，4℃条件静置12 h后，在4 000 r/min离心15 min，过滤得沉淀，用乙醇洗涤。脱蛋白：用热水将发酵液粗多糖溶解，冷却后反复3次去蛋白。脱色：多糖溶液加1.5%活性碳去色素，透析：将脱色后的虫草多糖溶液装入透析袋中，在蒸馏水中透析24 h，将3倍体积乙醇加于透析后溶液中，在4℃条件下沉淀过夜，离心得沉淀物并干燥，制得发酵液精多糖[3]。

2.4.3?沉淀物的处理?用研钵研碎发酵所制得的菌丝体，加蒸馏水至体积的10倍，水浴加热96～100℃条件下浸提3 h，反复浸提3次并将滤液合并，加入95%乙醇至4倍体积并低温沉淀过夜，离心制得沉淀，然后用乙醇和丙酮各洗涤2次，干燥，得粗多糖。

2.5?发酵液多糖的测定[4]

2.5.1?制作葡萄糖标准曲线?将葡萄糖标准溶液（100 μg/mL） 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL加入试管中，加蒸馏水至10.0 mL。用移液管分别移取2.0 mL加入比色管中。滴入重蒸苯酚溶液1.0 mL，震动摇晃均匀，立即加入浓硫酸5.0 mL摇匀，静置10 min，水浴加热30 min，温度40℃。

在波长490 nm处，测定每个管的吸光度，得A值（以2.0 mL蒸馏水作为空白）。横坐标为蔗糖浓度，纵坐标为吸光度A做标准曲线，制得回归方程：y=0.004 3x+0.029 9。

2.5.2?测定样品含量?将干燥至恒重的发酵液精多糖50 mg，用减量法称取后放置在100 mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，作标号Ⅰ。取样品液Ⅰ 1.0 mL，按刚制得的标准曲线方法，测定多糖溶液A值，平行测定3次。计算得出含量[5]。

3?结果

3.1?虫草多糖含量测定

冬虫夏草的产地不同，提取率也不同，其有效成分多糖的含量用苯酚一硫酸法测定结果也不同，测定结果见表1。

3.2?与蒽酮一硫酸法比较

取北虫草子实体，用蒽酮一硫酸法进行测定，得到4个样品的多糖含量数值分别为3.29%、3.50%、3.39%、3.30%，但是这种测定方法对于测定虫草发酵液的胞外多糖重现性不好，对测定结果的少部分蛋白影响较大。

4?讨论

4.1?浓硫酸对测定结果的影响

必须快速滴加浓硫酸，这样才能使高温瞬时产生，有利于多糖完全水解，如果滴加硫酸过慢，则不能产生高温条件，则多糖水解不完全，会给测定结果造成误差[6]。

4.2?苯酚对测定结果的影响

苯酚应配制成一定浓度的溶液，并且在整个检测过程中滴加苯酚动作要迅速，避免苯酚氧化变性，对测定结果产生影响。

现在虫草多糖的检测方法中，主要测定是粗多糖含量。用苯酚一硫酸法测定时，不需要虫草多糖的纯品和高级精密仪器，优点是灵敏度高、准确性高、精确度高、重现性好、简单快速等优点，可以作为对虫草多糖含量测定的最佳选择方法之一。

[参考文献]

[1] 袁建国，程显好，侯永勤，等.功能因子冬虫夏草多糖的研究开发[J].中国食品添加剂，1999（2）：18-22.

[2] 韩永萍，林强，何绪文.虫草菌丝体多糖的提取研究[J].中国食用菌，2007（6）：53-55.

[3] 来永斌，王琦，孙月.蛹虫草多糖含量的测定及分析[J].中成药，2001，23（7）：517-518.

[4] 闫文娟，李泰辉，唐芳永.广东虫草多糖的提取及含量测定[J].华南农业大学学报，2004（30）：53-56.

[5] 鲁晓岩.硫酸-苯酚法测定北冬虫夏草多糖含量[J].食品工业科技，2002，23（4）：69-70.

[6] 王祖华，张柯，李永程.冬虫夏草菌种的制备及液体培养基的优化[J].洛阳理工学院学报，2010，20（4）：10-12.

（收稿日期：2012-08-07）