原发性肝癌患者用血清、血浆标本测定循环VEGF浓度的差别

程洪涛 郭晨阳 黎海亮 肖金成 胡鸿涛 郑琳 宗登伟 余朴

[摘要] 目的 探索分析循环中VEGF浓度在血清和血浆中的差别，及其与血小板计数的关系。 方法 从20例未曾接受过治疗的原发性肝癌患者分别采取血清和血浆标本使用酶联免疫吸附法测定VEGF浓度做自身对照比较。同时分析血小板计数与血清VEGF和血浆VEGF的相关性。 结果 血清VEGF浓度显著高于血浆VEGF（P=0.000，Z=-3.920），血清和血浆VEGF浓度显著正相关（R=0.883，P=0.000）。血清、血浆VEGF浓度均与血小板计数正相关（R=0.652，P=0.002；R=0.487，P=0.029），血浆VEGF浓度与血小板计数相关性较弱。 结论 由于受外周血血小板计数的影响较小，血浆VEGF可能更适于监测原发性肝癌患者的血管生成状态。

[关键词] 癌；肝细胞；血管内皮生长因子；血清；血浆；酶联免疫吸附测定

[中图分类号] R735.7???[文献标识码] B???[文章编号] 2095-0616（2012）21-108-02

Difference between using serum and plasma samples in measuring circulating VEGF concentration of patients with primary liver cancer

CHENG?Hongtao??GUO?Chenyang??LI?Hailiang??XIAO?Jincheng??HU?Hongtao??ZHENG?Lin

ZONG?Dengwei??YU?Pu

Department of Radiology， Affiliated Cancer Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou 450008，China

[Abstract] Objective To explore and analyze the difference between serum and plasma in the circulating VEGF concentration and its relationship with platelet count. Methods Serum and plasma samples were collected from 20 untreated patients with primary liver cancer and the enzyme-linked immunosorbent assay was used to measure the VEGF concentration for self control comparison. Meanwhile the correlation between the platelet count and the serum VEGF and plasma VEGF was analyzed. Results The serum VEGF concentration was significantly higher than the plasma VEGF concentration（P=0.000， Z=-3.920）， with positive correlation between them （R=0.883，P=0.000）. Both serum and plasma VEGF concentrations were positively correlated to the platelet count（R=0.652，P=0.002；R=0.487，P=0.029）， but the correlation between the serum VEGF concentration and the platelet count was weak. Conclusion Due to the small influence from peripheral blood platelet count， plasma VEGF may be more suitable for the monitoring of angiogenesis state of patients with primary liver cancer.

[Key words] Cancer； Liver cells； Vascular endothelial growth factor； Serum； Plasma； Enzyme-linked immunosorbent assay

血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）在肝细胞肝癌的新血管形成过程中具有重要作用，对肝癌患者的预后有重要影响。多数血管生成因子是由肿瘤分泌的可扩散的可溶性肽链，理论上循环中的血管生成因子水平能够反映肿瘤血管生成的总体活性，通过外周血测定VEGF也可以反映出肿瘤血管生成活性[1]。用血清抑或血浆标本测定外周血VEGF可能获得不同的结果。本研究采用酶联免疫吸附法对两种标本测定外周血VEGF进行自身对照研究，初步探索更适于测定外周血VEGF的标本类型。

1?资料与方法

1.1?一般资料

2010年11月～2012年6月同时测定血清和血浆VEGF浓度的原发性肝癌患者20例，其中男14例，女6例，平均年龄为（59.4±10.9）岁。所有患者之前未接受过任何治疗，均于清晨空腹时于肘静脉抽取静脉血。

1.2?血浆标本的制备

血液标本3 mL注入含0.057 mL的15%乙二胺四乙酸三钾（K3EDTA）的消毒抗凝玻璃试管中，标本于1 h内低温离心（2 000 r/min、10 min），取上清分装于无菌干燥EP管中，并于-70℃冰箱保存。实验前20 min取出平衡至室温。

1.3?检测方法

血清和血浆VEGF浓度均采用检测采用双抗夹心酶联免疫吸附测定（ELISA）法，VEGF检测试剂购于上海蓝基生物公司（进口分装，灵敏度为1 pg/mL），用EL312e型酶标仪（Bio-Tek公司，美国）于波长450 nm条件下读取光密度值。所有样品及标准品均双孔检测。所有操作步骤均严格按照试剂使用手册进行。

1.4?统计学方法

用SPSS13.0软件进行统计分析，血清、血浆两种标本VEGF检测结果作正态性检验，对测试结果作配对样本比较的Wilcoxon 符号秩和检验，并进行血清、血浆VEGF浓度和血小板计数的相关分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2?结果

20例HCC患者的血清和血浆VEGF平均浓度分别为（117.30±96.7）pg/mL和（46.4±14.4）pg/mL；中位浓度分别为72.4 pg/mL（44.5～378.4）和44.0 pg/mL（33.3～79.1），血清VEGF浓度检测值显著高于血浆VEGF浓度检测值（P=0.000，Z= -3.920）。血清VEGF浓度与血浆VEGF浓度具有正相关性（R=0.883，P=0.000），血清和血浆VEGF浓度均与外周血血小板计数呈正相关，Spearman相关系数分别为（R=0.652，P=0.002）和（R=0.487，P=0.029），血浆VEGF浓度与血小板计数的相关性较弱。

3?讨论

目前，血管生成已被认为可能是HCC恶性转化和转移过程中的关键事件，HCC是一种高度血管化的肿瘤，血管生成在其肿瘤生物学中扮演着重要角色。肿瘤细胞可以诱导形成新生血管，通过血液为肿瘤提供营养。此过程触发了以内源性血管生成因子前体高表达和抗血管生成因子前体低表达为特征的“血管生成开关”。肿瘤细胞和其他基质细胞释放多种血管生成因子前体[2]。在治疗前准确测定肝癌患者血管生成因子的表达水平，对于提供抗血管生成的靶点并提供预后信息有重要价值。然而，测定肿瘤表达的血管生成因子，尤其是VEGF，需要像肿瘤微血管计数一样，依靠外科标本或活检材料才可做到，而且，利用诸如免疫组化染色之类的半定量技术还存在观察者相关的相当大的易变性。此外，肿瘤不同部位血管生成活性具有的不均质性，也会使精确测定肿瘤组织内的血管生成受到限制。由于多数血管生成因子是由肿瘤分泌的可扩散的可溶性肽链，理论上循环中的血管生成因子水平能够反映肿瘤血管生成的总体活性。越来越多的证据显示[3-4]，血液循环中的VEGF浓度在HCC的筛查和监测中具有潜在价值，血液循环中的VEGF水平可能是HCC预后的独立预测因子。血清VEGF高水平与肿瘤被膜消失、肝内转移发生、微静脉侵袭有显著关系，可作为肿瘤预后和转移的指标[5-7]。外周血取材方便，采用酶联免疫吸附法可以简便的测定外周血VEGF水平。本实验显示HCC患者的血清和血浆标本均可采用酶联免疫吸附法测出VEGF浓度。

本实验结果显示，血清VEGF浓度显著高于血浆VEGF浓度，差异有统计学意义（P=0.000，Z=-3.920），血清VEGF浓度波动较大，而血浆标本浓度波动度较小。由于血清标本在制备过程中又有体外凝血的作用，以及血小板脱颗粒的影响，血小板本身释出的VEGF进入标本，使得血清VEGF浓度波动较大，而血浆标本在抗凝剂作用下，将血小板对VEGF的影响最小化，且不易受到采血到离心的时间间隔的影响。因此，血浆VEGF浓度受血小板影响小，测定数据稳定，更能反映出肿瘤的血管生成活性。本研究结果显示，血清和血浆VEGF浓度均与血小板计数呈正相关关系，但是与血浆VEGF浓度相比，血清VEGF浓度与血小板计数的Spearman相关系数更高，说明血小板计数对血清和血浆VEGF浓度均有影响，这可能与血小板生理更新有关，血小板的平均寿命为10 d左右，衰老的血小板被清除时也可能释放出血小板源性的VEGF，从而对血浆VEGF浓度产生一定的影响。但使用血浆标本可以显著降低血小板对外周血VEGF浓度的影响。因此，与血清标本相比，用血浆标本测定外周血VEGF浓度能有有效降低血小板的影响，更能反映出肿瘤血管生成活性。用血浆标本测定VEGF，来研究其对HCC患者预后的影响正逐渐得到认可[3-4，8-9]。

测定外周血VEGF浓度与肿瘤组织VEGF相比具有一定的潜在优势。首先，前者可对所有肿瘤患者进行检测而不需要外科标本或活检取材；其次，允许在外科切除前进行评价肿瘤的血管生成活性，这有助于确定哪些患者需要新辅助治疗或其他治疗措施。第三，这是无创的，可以系列性的重复检测；第四，与用于肿瘤组织血管生成因子测定的免疫组化染色等半定量检测技术相比，定量免疫测定法检测循环中的血管生成因子具有更高的精确性。第五，循环中的血管生成因子检测费用较低且更加省时。血清VEGF 的水平受标本中血小板的量、标本处理方式、时间、凝血过程、温度等因素的影响，限制了其在肿瘤监测中的价值。检测血浆中的VEGF 则可能更加客观地反映肿瘤组织分泌VEGF 的情况。

[参考文献]

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（收稿日期：2012-09-04）