新的肿瘤血供模式——血管生成拟态的研究现状和意义

孙保存

肿瘤内的血管网络系统一方面保证肿瘤细胞的氧供、营养及代谢产物的排泄以促进肿瘤生长；另一方面，其管壁结构不完整，基底膜厚薄不一，利于瘤细胞进入管腔发生血道转移［1］，因而在肿瘤的生长及侵袭转移过程中具有重要作用。早在20世纪70年代，Folkman等［2］提出经典的肿瘤血管生成理论：肿瘤生长首先经历无血管期，当瘤体直径大于2毫米时不能单纯依赖弥散供氧，肿瘤细胞释放多种血管生成因子，引起血管内皮细胞形态改变，降解宿主毛细血管静脉端的基底膜，刺激血管内皮细胞迅速增殖并向肿瘤迁徙，逐步发育成为有功能的毛细血管袢，并与宿主血管相互吻合，构成肿瘤的血液循环系统。然而，1999年，美国学者Maniotis等［3］在对高侵袭性人眼葡萄膜黑色素瘤的研究中发现，即使直径大于1 cm，肿瘤也极少发生坏死，普通病理切片上并未发现由内皮细胞构成的新生血管，然而却发现一些与脉络膜血管相连的包含有红细胞的PAS染色阳性的管道样结构，且这些管道样结构与血管造影图存在一定的对应关系，提示这些管道能形成功能性微循环。这是一种完全不同于经典血管生成的微循环模式，由于这种管道样结构不是发生于已存在的内皮性血管而是从头生成的，且模仿内皮样血管的形态和功能，故将其命名为血管生成拟态（vasculogenic mimicry，VM）。VM概念的提出最初广受争议，许多研究者认为VM并不是一种功能性的微循环管道，而是肿瘤组织内出血和坏死造成的假象，不具备生物学意义［4-5］。然而在过去十几年中，我们和其他一些学者通过活性炭示踪、荧光染料及磁共振成像等技术手段均证实了由肿瘤细胞围成VM管道与内皮性血管相连通且其间存在流动的血浆和红细胞，同时越来越多的研究证实在乳腺癌、卵巢癌、胃癌、肝癌、胃肠道间质瘤、双向分化肿瘤等多种肿瘤组织中都存在VM［6-14］，提示这一现象对于肿瘤可能有着普遍意义。

与经典的肿瘤血管生成相比，VM管壁主要由基底膜围成，外衬以肿瘤细胞而不是内皮细胞，VM管腔内有血浆和红细胞流动。VM中红细胞漏出和微血栓形成情况少见且VM周围很少见到肿瘤坏死现象。大量研究结果表明VM多存在于高度恶性肿瘤组织中，有助于解释某些恶性肿瘤高侵袭、高转移的生物学行为。VM与宿主血管相连通有助于肿瘤血管网的构建以维持肿瘤的快速生长；VM增加肿瘤细胞与血液接触的机会，使肿瘤易于发生血道转移，肿瘤细胞与血流之间仅有一层PAS阳性的基底膜相隔，肿瘤细胞在释放蛋白水解酶溶解基底膜后能直接进入血流发生转移，且参与形成VM的肿瘤细胞由于具有更高的可塑性和“干性”而影响化疗与抗血管生成治疗的疗效，在乳腺癌、胃癌、肾透明细胞癌、肝癌、胆囊癌、腺泡横纹肌肉瘤、结肠癌等[6,15-19]的研究中均发现VM与肿瘤血行转移、复发及患者的生存期及预后密切相关。

为了明确这种特殊的肿瘤血供的形成机制，近十年来，诸多学者通过分子生物学与细胞生物学方法进行了多方面的探索。目前，VM发生机制的相关研究主要集中在肿瘤细胞去分化并向内皮细胞转分化、VM管道结构特点及促进VM形成的肿瘤特定微环境等方面。

肿瘤细胞模拟其他类型细胞的基因表达和生物学行为的特性被称为“可塑性”，它是VM形成的分子基础。Maniotis等在发现VM的同时注意到高侵袭性与低侵袭性的人黑色素瘤细胞在形成VM的能力上存在明显差异，他们运用cDNA微阵列分析了高、低侵袭性人黑色素瘤细胞基因表达差异，显示有210个差异基因表达，高侵袭性黑色素瘤能同时表达多种基因，包括上皮细胞、内皮细胞、成纤维母细胞等细胞表型的特异基因如VE-cadherin、Ephrin A2（EphA2）、组织因子途径抑制因子（TFPI）、CD34、酪氨酸激酶受体1、神经纤毛蛋白1,E-选择素、CD105、层粘连蛋白5γ2（laminin5γ2）、纤维连接蛋白（fibronectin）、Ⅳ型胶原（collagenⅣ）及Ⅰ型胶原（collagenⅠ）等，其中约15个基因与内皮/血管表型有关，而黑色素瘤细胞本身特异的分化标记如Melan-A，微眼炎相关转录因子及酪氨酸激酶等表达显著下调［3］。Hendrix等［20］发现高侵袭性黑色素瘤形成的VM管道样结构的过程与胚胎时期原始血管网的形成非常相似，且高表达血管内皮钙黏素（VE-cadherin）等与胚胎时期血管发育密切相关的基因。这些研究结果提示，在VM形成过程中，具有较强可塑性的肿瘤细胞就如同具有多向分化潜能的间充质干细胞，选择性地表达某些血管内皮细胞相关基因，获得血管内皮细胞样表型，“重演”了胚胎时期的血管形成过程，形成具有功能的微循环网络。

2010年，《自然》杂志同一期的两篇文章报道了胶质母细胞瘤中的肿瘤干样细胞转分化为血管内皮细胞而促进肿瘤血管生成，提示肿瘤细胞“干样特性”是VM形成的关键［21-22］。近年来，越来越多的研究表明经历上皮间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的肿瘤细胞可具有一些干样细胞的特性而更具恶性潜能［23-25］。另外，参与形成VM的肿瘤细胞模拟内皮细胞的功能和表型，而内皮细胞属于间充质细胞的一种，这些均提示EMT与VM具有密切关系，参与调控EMT的转录因子及信号转导通路在VM形成过程中可能具有重要作用。沿着这一思路，我们在不同肿瘤组织中进行了一系列的研究并取得了一些令人鼓舞的结果。在肝细胞性肝癌中，存在VM的组织中Twist1常高表达。体外实验中，增加Twist1的表达可显著提高肝细胞肝癌细胞形成VM管状结构的能力，而下调Twist1表达可降低其VM管状结构形成能力，进一步阐明Twist1可能通过调控VE-cadherin的转录和MMPs的活性参与调节肿瘤细胞“塑形性”，促进VM形成［17］。在结肠癌组织中，VM的存在与EMT重要转录因子ZEB1的表达密切相关。通过小干扰RNA（siRNA）下调ZEB1表达不仅抑制结肠癌细胞发生EMT还可降低肿瘤细胞Flk-1和VE-cadherin的表达并影响其VM管样结构的形成［26］。在结肠癌中，Wnt/β-catenin信号通路活化促进肿瘤细胞EMT并与VM形成密切相关，且Wnt/β-catenin信号通路抑制蛋白Dkk1可逆转结肠癌细胞EMT，抑制结肠癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力，增强细胞黏附能力，抑制结肠癌细胞干样细胞特性及干性标记蛋白CD133、Lgr5和内皮标记蛋白VE-cadherin的表达，抑制结肠癌细胞向内皮细胞转分化，影响VM形成。

除了肿瘤细胞的可塑性以外，细胞外基质重塑也是VM形成的重要过程。Hess等［27-28］首先发现EphA2通过使FAK去磷酸化及促进细胞外基质的重塑促进VM的形成，随后的一些研究表明EPHA2、VE-cadherin、PI3K、FAK等蛋白分子组成的一系列信号级联反应在VM形成过程中起重要作用，EPHA2、VE-cadherin等上游分子通过枢纽型分子PI3K的信号转导，激活下游分子MMP家族，促进层黏连蛋白5 γ2链分裂并沉积于细胞外基质，参与基质重塑与VM形成［28-29］。

VM形成亦与肿瘤微环境密切相关。缺氧环境可使包括高侵袭性黑素瘤细胞在内的恶性肿瘤细胞基因型发生改变，可塑性明显提高，替代机体血管内皮细胞行使构筑肿瘤血管的功能。本实验组前期研究也发现，在缺氧微环境中，黑色素瘤细胞高表达缺氧诱导因子（HIF-lα）诱导VM管道形成以获得足够供氧，而抑制HIF-lα表达可阻断VM形成，提示缺氧可促进VM形成且很可能是诱发VM形成的重要始动因素［28］。我们的研究发现在黑色素瘤中，局部缺氧和压力变化可以上调MMP-2、MMP-9的表达并诱导肿瘤细胞发生线形程序性坏死（linearly patterned programmed cell necrosis，LPPCN），可能为肿瘤实质中VM及新生血管的形成提供空间基础［29-30］。

国内外研究表明，cAMP、Galectin-3、Nodal、COX-2、Mig-7等也参与调控VM形成［31-36］。尽管目前对VM的相关研究已取得了较大进展，但其形成机制尚未完全明确。

经典的血管生成方式有血管生成和血管发生两种，前者是指已经存在的血管上的内皮细胞以出芽的方式生成新的血管；后者是指由内皮祖细胞分化为内皮细胞构成血管网。传统的微血管计数只能反映肿瘤组织中内皮依赖性血管的生长状态而忽略了VM这种特殊的肿瘤血液微循环模式，并不能全面的评估血管生成对肿瘤患者的临床意义和预后价值。VM的提出不仅改变了人们以往认为的内皮依赖性血管是肿瘤微循环唯一方式的传统观念，丰富了肿瘤血管生成理论，同时也有助于更深入阐明肿瘤的浸润与转移机制，为肿瘤的预后判断和治疗提供了新的思路。

VM这一血供模式的存在表明肿瘤细胞能向胚胎样的多能干细胞方向转化，且VM分子机制的研究初步证实肿瘤细胞的“塑形性”即“干细胞样特性”正是VM形成的关键。许多研究表明在VM形成过程中，肿瘤细胞可以通过胚胎样基因的逆转获得间充质细胞表型以模拟内皮细胞的行为并构成功能性微循环管道，而逆转EMT可以显著降低肿瘤细胞的“干性”和VM形成能力，这不仅使人们对肿瘤细胞的生物学性状有了新的认识，也极大地丰富了胚胎学、肿瘤干细胞理论。

贝伐单抗、内皮抑素（恩度）等肿瘤血管靶向药物在临床上的普遍应用表明抗血管生成治疗已经成为肿瘤治疗的重要手段［37］。但也有不少研究发现某些患者使用抗血管生成治疗效果不佳，甚至出现促进肿瘤进展的病例报告［38-40］。VM现象的存在某种程度上解释了为何单纯针对内皮细胞的抗血管生成治疗对某些患者并不能产生预期效果，提示我们在抗血管生成治疗中需同时兼顾内皮依赖性血管与VM才可能获得良好疗效。寻找调控VM的信号通路及关键作用靶点，筛选有效的针对VM的治疗药物对提高肿瘤治疗效果有着重要的现实意义。

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