维吾尔族妇女宫颈癌与TFPI-2基因启动区甲基化关系研究*

阿比班·阿克拉 阿比达·阿布都卡德尔 阿布力孜·阿布杜拉

人组织因子途径抑制物2，是一种Kunitz型蛋白酶抑制剂，可抑制降解细胞外基质的多种蛋白酶［1］。研究发现，在肿瘤发生、发展过程中，组织因子途径抑制物2（TFPI-2）常表达缺失［2］。基因启动子高甲基化主要发生在基因启动子区域CpG小岛，不改变蛋白质编码序列，但可以使基因转录表达失活，产生一系列基因的沉默［3］。近年来，DNA甲基化与宫颈癌的研究取得了巨大的进展，已有文献报道TFPI-2是宫颈癌相关基因的甲基化候选基因之一，从表观遗传学研究分析，TFPI-2基因的启动子甲基化修饰必然引起该基因转录水平下降［4］。新疆南部地区属我国子宫颈癌高发区之一，该地区维吾尔族妇女宫颈癌患病率及死亡率高，发病率比同一地区汉族妇女高3～4倍，病死率在全国少数民族中占第一位［5-6］，但是目前国内有关TFPI-2在宫颈癌中的研究报道并不多见。本研究应用MassARRAY甲基化DNA定量分析方法和半定量RT-PCR方法，研究维吾尔族妇女宫颈病变与TFPI-2基因启动子甲基化的关系，探讨该基因与宫颈癌发生发展进程，为维吾尔族子宫颈癌生物标志谱体系的建立、肿瘤的预测、综合防治及预后判断奠定基础。

1 材料与方法

1.1 临床资料

标本来源及分组：收集2008年7月至2009年4月在新疆医科大学第一附属医院和第三附属肿瘤医院妇科收治的维吾尔族妇女宫颈病变患者的手术切除或活检新鲜组织标本，其中宫颈癌（CSCC）患者25例，宫颈内瘤变CINⅠ/Ⅱ/Ⅲ患者14例和宫颈炎（CV）患者17例；为了制备组织RNA和半定量RT-PCR鉴定，收集新疆医科大学第一附属医院妇科在2011年9月至2012年2月收治的患者手术切除或活检新鲜组织标本共71例，包括CV25例，CINⅠ/Ⅱ/Ⅲ22例和CSCC 24例。所有组织标本均经病理诊断，年龄30～60岁，平均40岁，术前未接受放射治疗、化疗或免疫治疗，无合并或继发第二癌，临床资料完整。

1.2 试剂和仪器

试剂：蛋白酶K由美国Sigma公司提供，酚/氯仿、异丙醇、乙醇以及DEPC-treated water均购自上海生工，TRIzol总RNA提取试剂和Agarose琼脂糖粉是美国Invitrogen公司产品，cDNA合成试剂盒和，定量PCR试剂（Fermentas公司）。主要仪器有高速低温离心机（Allegra-64R，Beckmann Coulter）、核酸/蛋白快速测定仪（GeneQuant-II GE公司、德国），核酸凝胶成像系统（GelDoc-XR，Biorad），MassARRAY Compact System，梯度PCR仪（ABI9902，ABI美国）等。

1.3 实验方法

1.3.1 Sequenom MassARRAY甲基化DNA定量分析1）DNA制备及亚硫酸氢盐修饰：取30～100 mg冷冻组织标本，在液氮速冻状态下研磨粉碎后，加入细胞裂解液（5 mmol Tris-HCL，1 mmol EDTA，0.5%SDS，100 mmol NaCl），37℃ 1 h。后加蛋白酶 K，56℃过夜。次日采用经典的酚氯仿法抽提基因组DNA。经DNA定量和纯度测定，并以琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭（替代品）显色和紫外成像予以质检。取0.75～1 μg组织DNA，采用亚硫酸氢盐修饰专用试剂处理，其具体操作严格参照试剂盒说明书。2）PCR引物设计：利用 EpiDesigner设 计 软 件（http：//www.epidesigner.com，北京博奥生物有限公司）完成特定基因启动子区CpG片段扫描及特异性PCR引物设计，其引物序列不含任何CpG位点，扩增片段大小限制在200～600 bp。为了保证PCR产物的体外转录反应，在反向引物5'-末端整合T7-启动子序列（cagtaatacgactcact atagggagaaggctACTTACAAATTTCCCATTACTAAAAA，小写字母所示），在正向引物5'-末端增加10 bp Tag（aggaagagagAGTTTGAGGGGTGGTTGATTTAT），以平衡PCR反应。3）PCR扩增及体外转录：以亚硫酸氢盐修饰的组织DNA为模板，运用384孔板和7 μL/孔反应体系，经特异性引物PCR扩增目的基因片段后，加入碱性磷酸酶（Shrimp alkaline phosphatase，SAP）处理游离核苷酸。对PCR产物进行体外转录，加入Clean resin，混匀离心后备用（PCR Mass CLEAVE Reagent试剂盒美国SEQUENOM公司提供）。4）甲基化DNA定量分析：依托Sequenom MassARRAY甲基化DNA定量分析技术平台（北京博奥生物公司），按照自动化分析操作规程完成所有分析步骤，其中每一孔22 μL体外转录产物（cRNA）自动装入基质的芯片（Spectro-CHIPs；Sequenom，SanDiego），运用MassARRAY质谱仪（Bruker-Sequenom）收集质谱图，利用EpiTYPER软件完成数据分析。

1.3.2 半定量PCR检测 1）采用TRIzol试剂、酚/氯仿抽提和乙醇沉淀方法制备总RNA：所有试剂耗材均要求Dnase、Rnase-Free。取新鲜冷冻组织50～100 mg，在液氮冷冻状态下碾碎，放入1.5 mL的Ep管中；加入1 mL TRIzol试剂，震荡混匀，静置10 min；12 000 rpm，4℃离心5 min，取上清至一新EP管；加200 μL氯仿，混匀，室温放置2 min；12 000 rpm，4℃离心15 min后，液体呈现三相，小心吸取上清（约500 μL）置于新EP管，并加500 μL异丙醇充分混匀，室温静置10 min；将混合液12 000 rpm、4℃离心10 min后，管底可见白色沉淀（即为RNA）弃上清保留沉淀；加500 μL 75%酒精震荡混匀后，12 000 rpm、4℃离心15 min，弃上清；12 000 rpm、4℃离心30 s，弃去残余液体，空气中干燥约10～15 min，沉淀以30 μL DEPC-treated water溶解沉淀，经RNA定量和纯度测定，并以琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭（替代品）显色和紫外成像予以质检。-80℃保存待用。2）cDNA合成（逆转录）：按照试剂盒说明书合成cDNA（表1）。将上述混合液混匀，短暂离心后置于PCR仪上，65℃5 min后，取出立即置于冰上30 s，短暂离心。按照体系配置转录反应液（表2）。将混合液混匀，短暂离心后置于PCR仪上42℃60 min，70℃ 5 min，4℃待机。合成的产物cDNA直接用作模板，或-20℃保存。

表1 cDNA主要合成成份及量Table1 Synthesis of the main ingredients and quantities

表2 反转录反应体系Table2 Reverse transcription reaction system

1.3.3 RT-PCR检测 1）引物的设计与合成：根据TFPI-2、GAPDH mRNA的Genbank数据库序列，设计与合成其特异性引物（引物均由TAKARA公司合成并经质量检测）。2）半定量RT-PCR：以cDNA为模板进行PCR扩增，以不加模板的PCR体系为阴性对照，总体积25 μL（表3）。反应条件为：95℃预变性3 min，95℃变性 45 s，退火45 s，72℃延伸 1 min 30 s，72℃总延伸7 min，35个循环。扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。

表3 半定量RT-PCR反应体系Table3 Semiquantitative RT-PCR reaction system

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 TFPI-2启动子区CpG岛片段甲基化水平研究

通过Genebank（NCBI）人类基因组计划数据库搜索，获得了人类TFPI-2基因和mRNA序列（NG_044097和NM_006528），该基因定位于第7号染色体，含5个外显子和4个内含子。该数据库提供的mRNA序列含1 203碱基，TFPI-2基因组序列含24 324 bp，其转录起始点位于第10 000 bp（启动子区界点），而基因编码序列长度为14 324 bp，编码TFPI-2 RNA。应用Methyl Primer Express专业软件（ABI公司）对该基因的CpG岛分布进行预测分析，发现一个较长的片段区域（-1 004～+995 bp），并设计出一对扩增分析CpG片段的PCR引物，位于-329～-65 bp，CpG片段序列长度为263 bp。以此引物扩增亚硫酸氢盐修饰的组织DNA模板，获得单一PCR产物，并已测序确认（图1）。

图1 TFPI-2基因的典型DNA表达Figure1 Typical DNA expression map of the TFPI-2 gene

2.2 宫颈病变组织中TFPI-2启动子区的总体CpG岛片段甲基化水平分析

用t检验分析Sequenom MassArray质谱数据，宫颈癌组TFPI-2基因CpG片段甲基化水平增加为0.168±0.152，以宫颈炎组为对照，宫颈内瘤变组和宫颈癌之间进行两两比较，宫颈炎组与CIN组间无统计学意义（P＞0.5），而宫颈炎组和宫颈癌组间比较有显著性差异（P＜0.05）。

2.3 宫颈病变组织中TFPI-2启动子区CpG岛的单一CpG位点甲基化水平分析

精确定位到基因片段每个CpG单位的甲基化状态，用甲基化率量化每个CpG单位的甲基化程度，对数据进行t检验。可见随着病变发展该基因的单点甲基化水平逐渐增高，单点甲基化水平分析中，宫颈炎组与宫颈癌组比较具有显著统计学差异的甲基化位点有6个，分别为CpG_1，6，7，8，9和11等（P＜0.05，表4）。

表4 宫颈组织中TFPI-2基因单点甲基化水平分析Table4 TFPI-2 gene methylation analysis in cervical tissue

2.4 TFPI-2启动子区CpG岛中不同CpG位点相关性分析结果

为了明确每一个具有显著统计学差异的甲基化位点之间是否有关联性，利用CpG位点甲基化检测数据，对不同CpG位点分析两个位点相关性（表5），将两个位点相关系数接近1（P＜0.01），为两点之间相关性具有显著性，相互之间有密切关联性。

表5 TFPI-2基因甲基化单点相关性分析Table5 Single-point correlation analysis of TFPI-2 gene methylation

2.5 TFPI-2 mRNA表达水平与宫颈病变进程的关系

内参GAPDH引物对的扩增产物为138 bp（图2），TFPI-2引物对应的扩增产物为440 bp（图3），扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳验证：扩增片段长度和理论大小一致，且扩增条带单一，说明该引物有高度特异性。

在本研究所收集的病例标本范围内，TFPI-2基因在宫颈炎转录水平的相对表达量为（0.456 4±0.201 8），伴随着宫颈癌发病进程角度分析，在CINⅠ/Ⅱ/Ⅲ出现相对较低（0.398 8±0.321 3），在宫颈鳞癌组织内继续减少（0.262 3±0.217 8），而对总体mRNA表达水平进行方差分析F值为8.330，P为0.001。再以宫颈炎为对照各组间分别两两比较发现除宫颈炎组和CINⅠ/Ⅱ/Ⅲ组间差异不明显外（P＞0.05），其他两组间比较差异均有统计学意义。

图2 GAPDH扩增产物琼脂糖凝胶电泳Figure2 GAPDH amplification agarose gel electrophoresis

图3 TFPI-2扩增产物琼脂糖凝胶电泳Figure3 TFPI-2 amplification agarose gel electrophoresis

3 讨论

TFPI-2基因位于7q22，其表达产物是光谱的丝氨酸蛋白酶抑制物，在体外可强烈抑制纤溶酶、胰蛋白酶、金属蛋白酶-l和金属蛋白酶-3等［7-8］。进一步研究发现，其具有维持细胞外基质结构完整性以及调控肿瘤细胞血管生长，抑制内皮细胞增殖，从而抑制肿瘤细胞的侵袭、转移等多种生物功能。

体内多种组织器官广泛表达TFPI-2，而这些组织器官一旦发生肿瘤，TFPI-2的表达水平将随之下降。有研究证明，TFPI-2在绒毛膜癌、乳腺癌、前列腺癌、神经胶质细胞瘤、纤维肉瘤和胸部恶性肿瘤组织中表达水平下降可能与其启动子区甲基化有关。除此以外，TFPI-2启动子区的甲基化还与非小细胞肺癌和原发性胰腺导管癌有关［9］。

DNA甲基化是一种重要的表观遗传学现象，肿瘤细胞基因组整体水平低甲基化和特定基因启动子高度甲基化是已被公认的肿瘤表观遗传学机制，其中基因启动子区CpG岛（富含CpG区域）甲基化引起的基因转录水平降低或基因休眠是肿瘤发病机制研究的重要切入点。而且越来越多研究表明，检测肿瘤相关基因的甲基化状态，是一种很有前景的预测恶性肿瘤的生物标记［10］。

TFPI-2是重要的宫颈癌肿瘤特异性高甲基化候选基因［4］，然而，对于TFPI-2宫颈病变组织特异性和CpG位点甲基化水平差异研究报道较少。本研究应用MassARRY技术定量分析维吾尔族宫颈病变组织中该基因的甲基化水平。该研究平台是一种碱基特异性酶切与MALDI-TOF分析结合的质谱测序技术，选择某一种基因启动子区富含CG（CpG岛屿）片段，设计不含CpG的PCR引物，通过PCR扩增、酶切和质谱分析，输出目标片段的甲基化相关信息［11-12］。对TFPI-2基因CpG位点的目标片段进行了MassARRAY甲基化定量分析，获得TFPI-2基因12 CpG位点的定量分析数据，对整体甲基化水平进行统计学分析，宫颈炎组和CIN组之间没有统计学意义（P＞0.05），但宫颈炎组和宫颈癌组间具有显著性差异（P＜0.05）。由于PCR引物对目标片段的甲基化序列没有特异性，可以同步扩增甲基化或非甲基化片段，计算出某一CpG位点在组织DNA模板中的甲基化对非甲基化的比率。此外，临床组织DNA样品含有肿瘤细胞和正常细胞来源的DNA模板，即不同组织细胞DNA共存，其甲基化率反映了组织DNA样品的不均一性。对单点甲基化水平进行分析，发现其中6个位点甲基化比率明显高于CIN和宫颈炎，其差异显著（P＜0.05）。这些结果提示，mRNA在宫颈癌细胞中表达低下的原因，也就是说基因启动子区的高甲基化可能是影响其基因转录水平的原因之一。为了验证每两个具有显著差异的位点之间是否有关联性，计算各个位点的相关系数，发现其有显著的相关性（r＜0.5，P＜0.01），相关系数几乎接近1，可确定两位点关联的程度很密切。

本研究采用半定量RT-PCR技术，从TFPI-2基因转录水平对宫颈病变及宫颈癌组织进行了筛查分析，根据结果得知其差异显著（P＜0.05），但是CINⅡ/Ⅲ和宫颈鳞癌组之间差异无统计学意义，可见TFPI-2基因转录表达水平下调伴随着CIN和宫颈鳞癌发生。TFPI-2基因的异常甲基化、转录水平下调可能是该基因表达调控在同一宫颈病变组织中的不同层次表型，可能是宫颈鳞癌发生与发展的重要标记，可以成为宫颈鳞癌早期预警和诊断标志物体系的组成部分。

利用MassARRAY DNA甲基化水平定量分析（质谱测序技术），系统分析宫颈病变的高甲基化基因，是本课题研究的一大亮点，在国内外尚未见研究报道，基于新疆宫颈癌高发人群—维吾尔族妇女宫颈病变疾病资源的肿瘤特异性甲基化候选基因筛查是一种特色，但TFPI-2的作用机制、治疗方法以及能否真正成为宫颈癌治疗的有效靶点尚有待于进一步研究和观察。

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