人肺鳞癌组织中Caveolin-1的表达及预后意义*

马华玲 陈洪雷 朱润庆 郑明军 刘毓玲 范克非 杨为贵

肺鳞癌占原发性肺癌1/3且有较差的预后，寻找与肺鳞癌预后有关的生物学指标成为研究的热点。Caveolin-1［1］参与了各种信号分子和通路的调控，它与细胞的恶性增殖、侵袭和转移有关。Li等［2］在肺癌中的研究发现Caveolin-1的表达与淋巴结转移有关，但Caveolin-1与肺鳞癌预后的研究少见。本研究采用免疫组织化学法检测Caveolin-1在人肺鳞癌、正常肺组织中的表达，分析其与人肺鳞癌临床病理特征的关系；同时检测PCNA在人肺鳞癌中的表达，分析Cavelin-1和PCNA的相关性，探讨Caveolin-1表达在肺鳞癌中的预后意义。

1 材料与方法

1.1 病例来源

收集武钢总医院1998年1月至2008年12月病理存档蜡块肺鳞癌43例，正常肺组织16例。入选条件：1）均诊断明确且病理资料及临床随访资料完整；2）肿瘤分化程度，HE染色后由2名病理专家确诊。

1.2 临床资料

43例肺鳞癌中男36例，女7例；高分化18例，中分化12例，低分化13例；ⅠA+ⅠB期17例，ⅡA+ⅡB期10例，ⅢA+ⅢB期16例；伴淋巴结转移19例，无淋巴结转移24例；支气管残端有癌3例，支气管残端无癌40例。全部病例术前均未经放疗、化疗。电话或门诊随访患者出院后情况，随访至2011年12月；生存时间以月为单位。16例正常肺组织为距肿块3 cm以上的肺组织。

1.3 主要试剂和实验方法

浓缩型兔多抗Caveolin-1购自Santa Cruz公司，工作浓度为1∶100；即用型PCNA和超敏PV9000免疫组织化学试剂盒购自北京中杉金桥生物技术公司。

Caveolin-1、PCNA抗原修复均采用微波修复，其余步骤严格按照PV-9000二步法说明书进行，用PBS代替一抗做空白对照；肺鳞癌阳性片为阳性对照，DAB显色，苏木素复染，常规脱水透明封片。

1.4 免疫组织化学结果判定

Caveolin-1以细胞质/膜出现棕黄色颗粒为阳性；参照文献［3］结合阳性细胞百分比及染色强弱评分，阳性细胞计数：≤10%，0分；11%～25%，1分；26%～50%，2分；51%～75%，3分；＞75%，4分。染色强度分类：阴性，0分；弱，1分；中等，2分，强，3分。两者计分相乘＞2分者为阳性。PCNA以细胞核内出现棕黄色颗粒为阳性；计数至少500个肿瘤细胞，计算阳性率，阳性率＞20%的为阳性。

1.5 统计学处理

应用SPSS16.0软件，采用χ2检验和精确概率法分析Caveolin-1、PCNA表达与病理特征之间的关系，Caveolin-1与PCNA的相关性采用Spearman相关分析；采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，采用Log-rank检验比较组间的差异。P＜0.05为有显著性差异。

2 结果

2.1 Caveolin-1、PCNA在人肺鳞癌中的表达

正常肺组织中Caveolin-1的阳性表达位于肺泡上皮细胞、血管内皮细胞，而支气管黏膜上皮不表达（图1A）；肺鳞癌组织中Caveolin-1的阳性表达位于癌细胞胞质或胞膜内（图1B），并在分化好的鳞癌癌巢周边基底样细胞中的表达强于癌巢中央的细胞（图1C）。43例肺鳞癌组织中Caveolin-1的阳性率（44.19%）显著低于16例正常肺组织（100%，P＜0.001）。PCNA的阳性表达位于细胞核（图2），在人肺鳞癌中PCNA的阳性率为53.49%（23/43）。

图1 Caveolin-1的表达Figure1 Caveolin-1 expression in normal lung tissues and lung squamous cell carcinoma

图2 PCNA在肺鳞癌中的表达（PV9000×200）Figure2 PCNA expression in lung squamous cell carcinoma（PV9000×200）

2.2 Caveolin-1的表达与人肺鳞癌病理特征的关系

Caveolin-1阳性率随临床分期的上升而升高，差异有统计学意义（P=0.018）；Caveolin-1在有淋巴结转移组中的表达显著高于无淋巴结转移组（P=0.006）。Caveolin-1表达与肺鳞癌患者性别、年龄、分化程度、支气管残端有无癌残留均无关（P＞0.05）。Caveolin-1在PCNA（+）病例的阳性率高于PCNA（-）病例，两者表达呈正相关（r=0.360，P=0.018，表1）。

2.3 生存分析

2.3.1 Caveolin-1对人肺鳞癌患者生存预后的影响 患者随访至2011年12月，30例死亡，13例截尾。对Caveolin-1不同表达的肺鳞癌患者生存时间进行Kaplan-Meier统计显示：Caveolin-1阳性表达患者的生存时间显著低于Caveolin-1阴性表达者（P=0.007，图3）。对24例Caveolin-1不同表达的无淋巴结转移的肺鳞癌患者生存时间行Kaplan-Meier统计显示：Caveolin-1阳性表达的患者生存时间显著低于Caveolin-1阴性表达者（P=0.002，图4）。对19例Caveolin-1不同表达的淋巴结转移的肺鳞癌患者生存时间行Kaplan-Meier统计显示：Caveolin-1阳性表达患者的生存时间与Caveolin-1阴性表达者差异无统计学意义（P=0.333）。

2.3.2 单因素分析 单因素Cox生存分析结果显示：有淋巴结转移的患者生存时间显著低于无淋巴结转移者（P=0.008）；支气管残端有癌残留的患者生存时间显著低于支气管残端无癌残留者（P＜0.001）；且随患者TNM分期的升高，患者生存时间显著下降（P=0.001）；PCNA表达阳性的患者生存时间显著低于PCNA表达阴性者（P=0.011）。而患者的性别、年龄及分化程度与肺鳞癌患者生存时间无关（P＞0.05）。

2.3.3 多因素分析 将单因素分析中与患者生存时间相关的因素进行多因素分析。结果显示，Caveolin-1表达、TNM分期、支气管残端有无癌残留是肺鳞癌的独立预后因素；而患者淋巴结有无转移、PCNA表达不是肺鳞癌的独立预后因素（表2）。

表1 人肺鳞癌组织中Caveolin-1的表达与临床病理特征的关系 例Table1 Relationship between Caveolin-1 expression and clinicopathological features in lung squamous cell carcinoma

图3 43例肺鳞癌组织中Caveolin-1（+）组和Caveolin-1（-）组的生存曲线Figure3 Kaplan-Meier curves of 43 patients categorized into having Caveolin-1-positive and-negative expression

图4 24例淋巴结未转移组中Caveolin-1（+）和Caveolin-1(-)组的生存曲线Figure4 Kaplan-Meier curves showing shorter survival times for Caveolin-1-positive than Caveolin-1-negative patients without lymph node metastasis

表2 多因素Cox统计分析结果Table2 Results of Cox multivariate regression analysis

3 讨论

Caveolin-1作为肿瘤抑制因子，其在肺癌［4］、乳腺癌［5］中表达下调，本研究亦发现Caveolin-1在肺鳞癌组织中的表达显著低于正常肺组织；导致Caveolin-1在肺鳞癌中失活的原因及途径尚不清楚，可能与Caveolin-1突变、杂合性缺失、过甲基化有关［6］。本研究还发现正常肺组织中的支气管黏膜和化生的鳞状上皮中均不表达Caveolin-1，此结果提示肺鳞癌中Caveolin-1的表达与正常支气管黏膜无关；具体机理有待进一步研究。相对于正常肺组织而言，Caveolin-1在肺癌组织中总体表达下降，但本研究表明随着肺鳞癌临床分期的增高，Caveolin-1表达亦显著增高，有淋巴结转移组Caveolin-1的表达显著高于无淋巴结转移组；这与Chen等［4］在肺癌中的报道一致。至于Caveolin-1在肺鳞癌中表达的双面性，可能由于作为信号传导枢纽的Caveolin-1作用比较复杂，蛋白表达量可能会表现出不同的结果。本研究还发现Caveolin-1在分化好的肺鳞癌癌巢周边基底样细胞中的表达强于癌巢中央的细胞，该结果提示Caveolin-1可能通过癌巢外周的基底样细胞与癌间质细胞作用促进肿瘤扩散。本研究发现Caveolin-1与PCNA的表达呈正相关。提示在肺鳞癌中Caveolin-1的异常表达可能亦通过刺激细胞增殖调控该肿瘤的进展和转移。

Caveolin-1参与细胞增殖、新生血管生成，与肿瘤预后相关［7］。Du等［8］对Caveolin-1不同表达的鼻咽癌患者生存时间进行Kaplan-Meier统计显示：Caveolin-1阳性表达患者的生存时间显著低于Caveolin-1阴性表达者。Ando等［9］对食管鳞癌的研究显示Caveolin-1阳性表达患者的生存时间显著低于Caveolin-1阴性表达者。本研究亦显示Caveolin-1阳性表达患者的生存时间显著低于Caveolin-1阴性表达者，提示Caveolin-1表达上调为肿瘤预后的不良因素；进而对24例Caveolin-1不同表达的无淋巴结转移的患者生存时间进行生存分析显示，Caveolin-1阳性表达的患者生存期显著低于Caveolin-1阴性表达者；对19例Caveolin-1不同表达的淋巴结转移的患者生存时间进行生存分析显示，Caveolin-1阳性表达与Caveolin-1阴性表达患者的生存时间差异无统计学意义。该结果与Horiguchi等［10］在肾癌中的研究结果一致，提示Caveolin-1阳性表达的原发性肺鳞癌有侵袭转移的风险，Caveolin-1阳性患者术后应密切随访。对切除的肺鳞癌组织标本进行Caveolin-1检测，具有一定的临床应用前景。

单因素生存分析显示，患者的生存时间与TNM分期、淋巴结状态、PCNA状态和支气管残端有无癌残留有关。提示TNM分期、淋巴结状态和PCNA状态相对于其它临床病理因素而言对于肺鳞癌患者的预后具有更大的影响。手术的彻底性对于肺鳞癌患者的预后意义亦较大，故提倡手术治疗肺鳞癌时应尽最大可能的切除病灶。PCNA作为DNA聚合酶的辅助蛋白，能够客观地反映的恶性增殖分数和生长速度。研究［11］认为PCNA在一定程度上反映肿瘤恶性程度，对于分析判断肿瘤的预后有重要意义。多因素生存分析显示，Caveolin-1表达、TNM分期、支气管残端有无癌残留是影响肺鳞癌患者生存时间的显著因素，该结果与Cho等［12］在上尿路移行细胞癌的研究结果类似。因此，本研究认为Caveolin-1表达、TNM分期和支气管残端有无癌残留可作为判断肺鳞癌的预后指标。

综上所述，Caveolin-1参与与细胞恶性增殖、侵袭和转移有关，其表达水平与肺鳞癌的发生、发展、转移及预后有着密切的关系。Caveolin-1有可能成为指导肺鳞癌诊断和判断预后的一个重要生物学指标。

1 Burgermeister E,Liscovitch M,Röcken C,et al.Caveats of Caveolin-1 in cancer progression[J].Cancer Lett,2008,268(2):187-201.

2 Li M,Chen H,Diao L,et al.Caveolin-1 and VEGF-C promote lymph node metastasis in the absence of intratumoral lymphangiogenesis innon-small cell lung cancer[J].Tumori,2010,96(5):734-743.

3 Joo HJ,Oh DK,Kim YS,et al.Increased expression of Caveolin-1 and microvessel density correlates with metastasis and poor prognosis in clear cell renal cell carcinoma[J].BJU Int,2004,93(3):291-296.

4 Chen HL,Fan LF,Gao J,et al.Differential expression and function of the Caveolin-1 gene in non-small cell lung carcinoma[J].Oncol Rep,2011,25(2):359-366.

5 Witkiewicz AK,Dasgupta A,Sotgia F,et al.An absence of stromal Caveolin-1 expression predicts early tumor recurrence and poor clinical outcome in humanbreast cancers[J].Am J Pathol,2009,174(6):2023-2034.

6 Williams TM,Lisanti MP.Caveolin-1 in oncogenic transformation,cancer,and metastasis[J].Am J Physiol Cell Physiol,2005,288(3):C494-C506.

7 Nohata N,Hanazawa T,Kikkawa N,et al.Caveolin-1 mediates tumor cell migration and invasion and its regulation by miR-133a in head and necksquamous cell carcinoma[J].Int J Oncol,2011,38(1):209-217.

8 Du ZM,Hu CF,Shao Q,et al.Upregulation of Caveolin-1 and CD147 expression in nasopharyngeal carcinoma enhanced tumor cell migrationand correlated with poor prognosis of the patients[J].Int J Cancer,2009,125(8):1832-1841.

9 Ando T,Ishiguro H,Kimura M,et al.The overexpression of Caveolin-1 and caveolin-2 correlates with a poor prognosis and tumor progression inesophageal squamous cell carcinoma[J].Oncol Rep,2007,18(3):601-609.

10 Horiguchi A,Asano T,Asakuma J,et al.Impact of Caveolin-1 expression on clinicopathological parameters in renal cell carcinoma[J].J Urol,2004,172(2):718-722.

11 Kato K,Kawashiri S,Yoshizawa K,et al.Expression form of p53 and PCNA at the invasive front in oral squamous cell carcinoma:correlation withclinicopathological features and prognosis[J].J Oral Pathol Med,2011[Epub ahead of print].

12 Cho DS,Yim H,Cho KS,et al.Impact of Caveolin-1 expression on the prognosis of transitional cell carcinoma of the upper urinary tract[J].J Korean Med Sci,2008,23(2):296-301.