广泛耐药鲍曼不动杆菌对氨基糖苷类耐药机制的研究

张丽花 蔡培泉 王春新

1.张家港市第一人民医院检验科，江苏张家港 215600；2.南京医科大学附属无锡人民医院，江苏无锡 214023

广泛耐药鲍曼不动杆菌对氨基糖苷类耐药机制的研究

张丽花1蔡培泉2王春新2

1.张家港市第一人民医院检验科，江苏张家港 215600；2.南京医科大学附属无锡人民医院，江苏无锡 214023

目的 调查广泛耐药鲍曼不动杆菌(Extensively drug Resistant Acinetobacter Baumannii，XDR-ABA)临床分离菌株中氨基糖苷类修饰酶基因、16SrRNA甲基化酶基因和外排泵基因的存在情况。方法 收集2011年1—12月临床标本中分离的XDR-ABA菌20株，采用微量肉汤稀释法进行抗菌药物敏感性试验，聚合酶链反应（PCR）方法分析9种氨基糖苷类修饰酶基因、6种16SrRNA甲基化酶基因和外排泵基因adeB。 结果 20株 XDR-ABA菌均检出 aac(6’)-Ⅰb、ant(2”)-Ⅰ、ant(3”)-Ⅰ、aphA1和adeB外排泵基因，其余5种氨基糖苷类修饰酶基因和6种16SrRNA甲基化酶基因和均未检出。 结论 该组20株XDR-ABA菌耐多种氨基糖苷类药物与细菌产aac(6’)-Ⅰb、ant(2”)-Ⅰ、ant(3”)-Ⅰ、aphA1 4种氨基糖苷类修饰酶和存在adeABC外排泵系统相关。

鲍曼不动杆菌；氨基糖苷类修饰酶基因；16SrRNA甲基化酶基因；外排泵；广泛耐药

鲍曼不动杆菌（Acinetobacter Baumannii,ABA）是近年来被关注的愈来愈多的机会性致病菌，是医院感染的常见致病菌，现在其正缓慢但成功的逐渐成为社区或健康护理相关感染的常见病原菌，可能引起身体任何部位的感染而不仅仅是一个或两个系统[1]。从1944年开始首个氨基糖苷类抗生素链霉素进入临床，其杀菌机制主要是通过与30S核糖体亚基解码区的16S rRNA连接而抑制蛋白质合成并扰乱细胞膜的完整性[2]。氨基糖苷类对包括鲍曼不动杆菌在内的革兰阴性杆菌具有强大的抗菌活性，但近年来鲍曼不动杆菌的耐药性迅速发展而致对氨基糖苷类敏感性下降[3-4]。为了进一步了解ABA对氨基糖苷类的耐药机制，我们对该院分离的20株ABA进行了氨基糖苷类耐药相关基因的检测，包括9种氨基糖苷类修饰酶基因 （aac3-Ⅰ、aac3-Ⅱ、aac6’-Ⅰad、aac6‘-Ⅰb、aac6’-Ⅱ、ant2’’-Ⅰ、ant3‘‘-Ⅰ、ant4’-Ⅰ、aph3 ‘-Ⅰ）、6 种 16S rRNA 甲基化酶基因（armA、rmtA、rmtB、rmtC、rmtD、npmA）以及 1 种外排泵基因（adeB），现报道如下。

1 资料与方法

1.1 菌株

20株ABA菌株全部来自2011年1—12月无锡市人民医院住院患者的临床标本，标本分布为：痰液17份，尿液2份，血液1份。

1.2 细菌鉴定和药敏试验

所有菌株鉴定和药敏试验采用VITEK-compact全自动微生物分析系统，由于生化分析法不能区分ABA与乙酸钙不动杆菌，该研究并作了gyrA和parC基因扩增与产物测序(gyrA基因引物为[P1:5’-AAATCTGCCCGTGTCGTTGGT-3’；P2:5’-GCCATACCTACGGCGATACC-3’]和 parC 基因引物为[P1:5’-AAACCTGTTCAGCGCCGCATT-3’；P2:5’-AAAGTTGTCTTGCCATTCACT-3’])，测得序列经BLASTn比对进一步确认为ABA，试剂盒由无锡市克隆遗传技术研究所提供。药敏试验抗菌药物包括：阿米卡星、氨苄西林、头孢唑肟、头孢吡肟、头孢哌酮/舒巴坦、头孢噻肟、头孢西丁、头孢他啶、头孢呋辛钠、头孢呋辛酯、庆大霉素、亚胺培南、左旋氧氟沙星、美罗培南及哌拉西林/他唑巴坦。质控菌株为鲍曼不动杆菌ATCC19606，购自卫生部临床检验中心。20株ABA对15种抗菌药物均呈耐药。对筛选出的20株AB利用微量肉汤稀释法对多粘菌素B和E进行敏感性测定，均为敏感。根据文献[5]，判定该组ABA为广泛耐药鲍曼不动杆菌（Extensively drug Resistant Acinetobacter Baumannii,XDR-ABA）。

1.3 细菌处理

挑纯培养菌落置入0.5 mL离心管内 （内预置200 ng/mL蛋白酶K溶液 400 μL）,56℃水浴2 h，改95℃水浴10 min。即为基因检测的模板液，-20℃冰箱保存备用。

1.4 基因检测

9 种氨基糖苷类修饰酶基因（aac3-Ⅰ、aac3-Ⅱ、aac6’-Ⅰad、aac6 ‘-Ⅰb、aac6’-Ⅱ、ant2’’-Ⅰ、ant3 ‘‘-Ⅰ、ant4’-Ⅰ、aph3‘-Ⅰ）、6 种 16S rRNA 甲基化酶基因（armA、rmtA、rmtB、rmtC、rmtD、npmA）和外排泵基因（adeB）的检测均为PCR法。PCR扩增试剂盒、靶基因PCR引物序列和阳性对照DNA由无锡市克隆遗传技术研究所提供，检测按说明书进行。

1.5 阳性基因测序

PCR阳性产物由PCR直接全自动荧光法测序，委托上海铂尚生物技术有限公司完成 (测序在美国ABI公司3730型毛细管全自动测序仪上进行。

1.6 测得序列比对

读序工具软件为Chromas，测序结果用Chromas直接作BLAST Search比对。

2 结果

20株XDR-ABA检测阳性的基因为4种氨基糖苷类修饰酶基因（aac6‘-Ⅰb、ant2’’-Ⅰ、ant3‘‘-Ⅰ和 aph3‘-Ⅰ）和 1 种外排泵基因（adeB），而其它的5种氨基糖苷类修饰酶基因和全部的6种16S rRNA甲基化酶基因的检测均为阴性。aph3‘-Ⅰ型氨基糖苷类修饰酶基因序列与文献报道一致[6]，aph3‘-Ⅰ基因测序图（部分）见图 1。

3 讨论

鲍曼不动杆菌作为医院感染的重要病原菌的主要原因为：①鲍曼不动杆菌通过不同的途径积聚多种耐药机制的卓越能力，包括突变和获得遗传元件，如质粒、整合子、转座子或耐药基因岛；②可长时间在环境中生存的能力，并联合其固有的耐干燥和消毒剂的能力，且其形成生物膜的能力也有帮助[7]。国内的一个包括1 879株革兰阴性杆菌的研究显示，鲍曼不动杆菌的检出率为14.37%（395株），而对氨基糖苷类的耐药率为57.91%～100.00%，从2004—2011年对奈替米星和妥布霉素的敏感率呈逐年下降趋势[8]。美国报道的包括29家医院的调查显示，从2002—2009年期间氨基糖苷类抗生素的平均使用量下降了41%，但鲍曼不动杆菌对其耐药率无明显变化[9]，显示鲍曼不动杆菌耐氨基糖苷类抗生素的严峻形势。

图1 aph3‘-Ⅰ基因测序图（部分）

对氨基糖苷类的耐药机制有：①产生修饰或灭活氨基糖苷类抗生素的转移酶或钝化酶，如乙酰化酶和磷酸化酶；②氨基糖苷类抗生素的靶位改变；③细胞膜通透性改变或细胞内转运异常，使得药物在细胞内积累减少从而导致耐药，如外排泵的过表达[2]。鲍曼不动杆菌修饰氨基糖苷类的酶包括乙酰转移酶（Aminoglycoside Acetyltransferases，AAC）、核苷酸转移酶（Aminoglycoside Nucleotidyltransferases，ANT） 和磷酸转移酶（Aminoglycoside Phosphotransferases，APH）。该实验中的鲍曼不动杆菌药敏试验显示其对阿米卡星和庆大霉素耐药，且三种修饰酶均有检测到，表明鲍曼不动杆菌对氨基糖苷类抗生素的修饰是多机制的。近来有研究显示在AAC以及腺嘌呤转移酶（Aminoglycoside Adenyl Transferase，AAD）的编码基因的领导（leader）RNA 中存在核糖开关（riboswitch），抗生素连接到领导RNA上可诱导氨基糖苷类耐药[10]。该实验共检测出了4种氨基糖苷类修饰酶基因，其中的aph3‘-Ⅰ型氨基糖苷修饰酶为该院许亚丰等人发现的新的磷酸转移酶基因（美国Genbank登录号为JF519620，2011年5月1日公布）。该实验所检测出的4种氨基糖苷类修饰酶基因与许亚丰等人检测的结果一致，且序列对比亦显示无有义突变。

从2003年至今已鉴定出7种16S rRNA甲基化酶基因，包括 armA、rmtA、rmtB、rmtC、rmtD、rmtE 和 npmA11。 报道显示高度耐阿米卡星(≥512 μg/mL)的革兰阴性菌有 97.5%（193/198）携带16S rRNA甲基化酶基因[11]，但我们试验中的鲍曼不动杆菌均未检测出16S rRNA甲基化酶基因，虽然药敏试验显示均耐阿米卡星，表明携带16S rRNA甲基化酶基因的鲍曼不动杆菌尚未在该院造成流行。

一个包括1189株来自南非、欧洲、中国、拉丁美洲和地中海国家的不动杆菌属的大型研究显示98%的分离株携带多药外排运输系统AdeABC12。庆大霉素和奈替米星是AdeABC外排泵的最佳底物，3个连续的成群基因adeA、adeB和adeC编码的蛋白质分别同源于膜融合、药物转运体和外膜成分，这是耐药结节细胞分裂（Resistance-Nodulation-cell Division，RND）外排泵家族的特性[13]。adeABC的表达是受一个两成分的系统AdeRS所调控的，这个系统包括一个反应调节者（AdeR）和一个感受器激酶（AdeS），庆大霉素存在时adeS和adeR发生突变而使得adeABC的表达增多而产生耐药[14]。在外排泵抑制剂1-(1-萘基甲基)-哌嗪（1-(1-Naphtylmethyl)-Piperazine，NMP）存在的情况下一株耐庆大霉素的鲍曼不动杆菌变为中介耐药，NMP虽然增大了抑菌圈的直径却不足以恢复敏感性[15]。我们的实验显示所有的20株XDRABA均携带adeB基因且均对庆大霉素耐药，而庆大霉素的修饰酶罕有报道，因此可初步判断adeB基因的存在是该研究中XDR-ABA耐庆大霉素的原因。

该实验从鲍曼不动杆菌耐氨基糖苷类的三个机制方面分别进行了研究，检测阳性的有4种氨基糖苷类修饰酶基因和1种外排泵基因，而16SrRNA甲基化酶基因的检测为阴性，显示该院流行的鲍曼不动杆菌耐氨基糖苷类抗生素是两种机制联合造成的。

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Study on Aminoglycoside Antibiotic Resistant Mechanism in Extensively Drug Resistant Acinetobacter Baumannii

ZHANG Lihua1CAI Peiquan2WANG Chunxin2
1.Clinical Laboratory,Zhangjiagang First People's Hospital,Suzhou,Jiangsu Province,215600，China;2.Wuxi People's Hospital Affiliated to Nanjing Medical University，Wuxi,Jiangsu Province,214023，China

Objective To investigate the distribution of aminoglycoside modifying enzyme genes,16SrRNA methylase genes and adeB efflux pump gene in extensively drug resistant acinetobacter baumannii(XDR-ABA).Methods From January,2011 to December,2011,20 strains of XDR-ABA were collected from clinical specimen.Antimicrobial susceptibility test was performed by broth microdilution method and 9 kinds of aminoglycoside modifying enzyme genes,6 kinds of 16SrRNA methylase genes and adeB efflux pump gene were analyzed by PCR.Results All 20 strains of XDR-ABA were positive for 4 kinds of aminoglycoside modifying enzyme genes aac(6')-Ⅰb,ant(2")-Ⅰ,ant(3")-Ⅰand aphA1 and adeB efflux pump gene,negative for other 5 kinds of aminoglycoside modifying enzyme genes and 6 kinds of 16SrRNA methylase genes in PCR assays.Conclusion In this group of XDR-ABA,4 kinds of aminoglycoside modifying enzyme genes aac(6')-Ⅰb,ant(2")-Ⅰ,ant(3")-Ⅰand aphA1 and adeB efflux pump system might play a role in resistance to aminoglycoside antimicrobial agents.

Acinetobacter baumanii;Aminoglycoside modifying enzyme gene;16SrRNA methylase gene;Efflux pump;Extensive drug resistance

R450

A

1674-0742（2013）12（b）－0010-02

无锡市医院管理中心医学技术联合攻关项目(YGZX1212)；南京医科大学科技发展基金重点项目（2012NJMU171）。

张丽花（1971-），女，江苏张家港人，副主任技师，研究方向：临床微生物检测。

王春新，副研究员，副主任技师，研究方向：临床微生物检测，E-mail：wangcx_wxph@163.com。

2013-10-28）