MICA基因多态性、巨细胞病毒感染与溃疡性结肠炎的相关性

伍楚蓉 杨 文 黄红东 罗 宁 (南方医科大学附属南海人民医院肿瘤一科，广东 佛山 5800)

炎症性肠病(IBD)，包括克罗恩病(CD)和溃疡性结肠炎(UC)，是病因不明确的慢性肠道炎症，多在中青年轻发病，呈慢性反复发作过程，以黏血便、腹泻、腹痛、消瘦和贫血为主要表现，严重时可发生中毒性巨结肠、肠穿孔、肠梗阻、肠出血及癌变等并发症。虽然研究发现IBD的发生主要与肠道免疫应答异常密切关系，但是病因及发病机制仍不太清楚，目前国内外大多数学者认为是由于多因素相互作用所致，肠黏膜免疫调节异常、持续的肠道感染、肠黏膜屏障缺损、遗传和环境等共同参与疾病的发生过程〔1，2〕。传统的流行病学研究显示IBD具有遗传易感性，家族聚集现象、单卵双生子同患率高于双卵双生子、犹太人发病率高以及UC易伴发一些免疫或遗传性疾病等方面〔3〕。对中国人群的基因多态性分布以及与UC的相关性研究发现 MICA、MICB、CTLA-4、MTHFR 与 UC 相关〔4～6〕，未见其他基因与UC相关，这提示我国UC基因型分布与欧美国家不同，IBD遗传易感性存在种族差异。

1 MICA基因多态性与UC的相关性

MIC(major histocompatibility complex classⅠchain-related gene)基因与MHC-Ⅰ类基因相连锁，同源性很高，具有较高的基因多态性，但分子结构、功能和组织分布不同于经典的HLAⅠ类基因。MICA基因与HLA-B彼邻，距HLA-B着丝粒端仅40 kb。MICA基因全长11 722 bp，编码1 382 bp的转录子，包括6个外显子(exon 1～6)。Exon 1编码L前导肽，exon 2～4分别编码细胞外α1、α2和α3结构域，exon5编码跨膜 (TM)区，exon6编码胞内区。在MICA基因的跨膜区发现了微卫星(GCT)。目前，已发现7个等位基因，分别命名为 A4、A5、A5.1、A6、A7、A9 和 A10，数字代表了 GCT 的重复数，A5.1 是由5个GCT重复顺序再加上一个额外核苷酸插入成的序列(GGCT)，导致移码突变，在TM区产生早现的终止密码子，编码胞内区截短的MICA分子。MICA等位基因与HLA-B基因的紧密连锁，研究表明MICA已成为某些MHC相关的自身免疫性疾病的候选基因，如强直性脊柱炎、类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、寻常银屑病、Addison病、Behcet病、胰岛素依赖性糖尿病、乳糜泻病及IBD等〔7～12〕，而且在器官移植的相关性研究中也成为研究热点〔13〕。尽管人类MICA基因多态性与多种自身免疫性疾病相关，但是这种多态性功能性相关机制仍然不明确〔14，15〕。

MICA蛋白主要分布在上皮细胞系中，尤其是胃肠道上皮细胞，多年研究结果显示MICA可能是一种应激性蛋白标志，高温、病毒或感染、DNA损伤等因素均可致细胞表面MIC蛋白表达增加。MICA的受体NKG2D为C型凝集素，是NK细胞上最常见的受体，在绝大多数γδT细胞、CD8+αβT细胞和NK细胞、激活的 CD4+T细胞表面上都可检测到〔16～18〕。NKG2D 通过与感染的细胞、过度应激细胞、肿瘤细胞表面诱导产生的配体结合，从而激活 NK细胞，δγT细胞、CD8+T细胞表面以及CD4+T细胞发挥相应的杀细胞活性。NKG2D受体与转接蛋白结合来分别传递协同刺激信号或完全激活信号〔19〕，NKG2D有两种转接蛋白，DAP10和DAP12，他们与NKG2D，DAP12细胞质区内含有免疫受体酪氨酸活基序(ITAM)，NKG2D受体与其结合产生完全激活信号;但是DAP10与DAP12不同，DAP10胞质区含有YxxM基序，NKG2D通过起产生协同刺激信号。NK细胞在激活的情况下产生完全和协同两种激活途径对细胞产生杀伤作用。通过DAP10产生的信号能够增强NK细胞的细胞毒活性，通过DAP12传递活化信号可以促进NK细胞产生INF-γ，消除肿瘤、杀伤体外培养的肿瘤细胞〔20〕。NKG2D 受体与MICA结合部位是在MICA分子胞外区，故MICA 2～4外显子多态性对疾病的发生有比较重要作用，MICA微卫星多态性决定胞内区尾端的缺失与否，对形成可溶性MICA分子相关。

研究发现MICA*A5.1等位基因编码的蛋白与其他的6个相关的等位基因的表达产物相比，缺失了胞内区和部分跨膜区。Suemizu等〔21〕发现了MICA*A5.1等位基因对应的截短型的MICA分子表达于细胞表面的顶端，而全长型的MICA分子则表达于细胞表面的基底外侧，该部位正好与上皮细胞内的T细胞和NK细胞相互作用。对MICA*A5.1等位基因编码的MICA分子在细胞顶端。国外学者把MICA*A5.1等位基因转染到宿主细胞里，发现这种胞内区截短的MICA蛋白表达分布于顶端细胞表面，而MICA*A5等位基因对应的全长型MICA蛋白表达分布于基底细胞外侧。并通过定点突变发现Leu-Val(344-345)是MICA蛋白表达于细胞基底部的必要条件。而MICA*A5.1等位基因对应的氨基酸序列终止于第304位，因此可以解释为什么MICA*A5.1等位基因对应的蛋白表达与细胞的位置发生改变〔21〕。Leu-Val(344-345)是MICA在细胞膜上稳定的必要氨基酸序列，在MICA分子细胞质尾部，在肠上皮细胞表面，也是NK和TIELs，因此也是与之接触发挥作用的首要条件，因此，MICA*A5.1不正确的跨膜位置似乎有道理的解释为免疫功能的缺陷基础和在天然免疫中的不利作用。研究报道，MICA*A5.1与许多自身免疫性疾病相关，如糖尿病、乳糜泻、类风湿关节炎、白塞病等相关，但是MICA*A5.1如何影响自身免疫的进程仍然不明确。Gambelunghe等〔22〕报道MICA*A5.1基因与SLE正相关，但是起引起自身免疫性疾病疾病的具体发病机制仍然不明确。

NK细胞、δγT细胞、CD8+T细胞在感染、移植及其他的应激性细胞的免疫监视中而不激活自身免疫反应，这是NK细胞和CD8+T细胞的内在特性。NK细胞的激活受抑制性受体和激活性受体控制，这些受体的配体在一些潜在的靶细胞表达，正常情况下，NK细胞大量的抑制性受体识别正常细胞的负性调节的控制而不被激活。在感染、移植或应激情况下通过减少抑制性受体配体或者增加激活性受体配体的表达克服这些自身耐受的抑制，这些激活性配体和抑制性配体的表达平衡将会决定某些细胞是否成为NK细胞介导的杀伤靶细胞〔23〕。大部分激活性NK细胞受体也在CD8+T细胞表面表达，通过特异性抗原使TCR受体激活的阈值降低。因此，异常的NK细胞和T细胞受体配体增减可能诱导NK细胞或T细胞介导自身免疫反应。MICA/B是应激性诱导蛋白通过激活性受体NKG2D激活NK细胞和CD8+T细胞〔24〕。NKG2D表达在所有的人NK细胞、δγT细胞、CD8+T细胞表面，潜在的靶细胞表面的配体与NKG2D结合可能打破免疫耐受，如果通过炎症过程诱导MIC分子非特异性表达或者易感体质个体异常表达，可引发或加重自身免疫性反应的发生。

自身反应性是免疫介导的自身组织或者细胞破坏，这个过程直到抗原消除瞬间消失或者持续存在。这些可能是通过T细胞直接的破坏作用或者是细胞因子介导的对宿主组织的细胞毒性破坏作用。NKG2D及配体在肿瘤和感染行疾病中对有免疫监视作用，但是在自身免疫性疾病疾病中可能是有害的，在肿瘤MICA与NKG2D结合发挥细胞毒效应杀死肿瘤细胞发挥免疫监视作用，在应激情况下，肠上皮组织高表达MIC分子，MIC分子通过NKG2D激活NK细胞或者CD8+T细胞，使对自身组织产生杀伤机制。在自身免疫性疾病中MICA分子作为自身抗原与表达有NKG2D受体的免疫细胞结合发挥细胞毒作用杀伤感染或应激性细胞，对自身组织产生破坏性作用，导致局部黏膜组织炎症的发生。

NKG2D和配体自身免疫性疾病发病过程中的作用首次在类风湿关节炎的发病过程中发现〔25〕，类风湿关节炎的严重程度与外周血和关节炎炎性组织中大量的CD4+CD28－T细胞相关，并发现这些CD4+T细胞都表达NKG2D受体，而在正常的CD4+T细胞表面表达缺失。TNF和IL-15诱导NKG2D的表达，TNF和IL-15在炎性关节滑液和RA患者的血清中大量存在。再者，RA患者异常性的高表达MIC配体，MIC配体能够刺激自身固有的CD4+CD28－T增殖和分泌INFγ，RA患者的血清中的可溶性MICA含量增加，而这些可溶性MICA是关节滑液来源的，sMICA没能下调NKG2D的表达，反而表达增加，这主要是肿瘤坏死因子(TNF)和白介素-15(IL-15)的相反的调节作用增强NKG2D的表达。NKG2D的调节异常和组织中MIC的异常表达能够引起T细胞的激活，NKG2D的特异性表达和MIC分子的异常表达在靶器官组织中的环境中能够引起自身反应性T细胞的激活，因此引起自身持久的病理反应〔26〕。最近研究表明，在细胞特异性特点上NKG2D信号与IL-15受体机制是一致的〔27，28〕。研究发现人MICA基因多态性与胰岛素依赖型糖尿病相关，但是这种多态性的功能相关性仍然不明确，但是很多对非肥胖型糖尿病小鼠(NOD)模型研究，NKG2D与配体参与自身免疫性糖尿病的发病过程〔29〕，NOD小鼠表达NKG2D配体，并且浸润在胰腺中的自身反应性CD8+T细胞表达有NKG2D受体，抗NKG2D抗体治疗抑制自身反应性CD8+T细胞的功能，前驱期糖尿病能够完全阻止糖尿病的进展。

传统上认为NKG2D是一种TCR的共刺激分子不能独立地显示其功能，最近的研究表明乳糜泻的研究表明IL-15和IL-2诱导CD8+T细胞表达NKG2D分子，能够通过NKG2D分子独立发挥细胞毒性功能。在CD的研究中，高剂量IL-2刺激的CD4+NKG2D+T细胞在无TCR信号介导的情况下能够单独发挥细胞毒性作用，IL-15能都上调CD病人的CD4+NKG2D+T细胞NKG2D受体的表达〔30，31〕。最近研究表明IL-15和TNF-α诱导CD4+T细胞表面表达 NKG2D受体，IL-15能够诱导CD4+T和CD8+T细胞增殖，CD4+T细胞在增长的同时能够显著表达NKG2D受体。MICA在肠道上皮细胞高表达，这些CD4+NKG2D+T细胞毒性T细胞能诱导肠道黏膜的破坏。最近研究表明IL-12和IL-15能够诱导T细胞表面NKG2D的表达而增加细胞的细胞毒性〔32〕。

已经证明乳糜泻病人肠道上皮中高表达MIC分子与NKG2D分子激活对疾病的发展有关。MIC蛋白在细胞内表达，在在活动性CD病人肠道上皮高表达，并且随着疾病的痊愈而降低。乳糜泻病人中肠上皮细胞中IL-15高表达，在NKG2D介导的应激的上皮细胞中产生的IL-15一是能够诱导MIC分子，二是通过识别肠道上皮细胞的MIC分子，改变肠上皮淋巴细胞的抗原特异性T细胞转变成为TCR受体特异性的细胞毒性功能〔33～35〕。Ito等〔36〕研究发现调节 NKG2D 信号通路能够控制实验性大鼠慢性结肠炎症。Kjellev等〔37〕通过实验性大鼠研究发现CD4(+)NKG2D(+)T细胞在实验性结肠炎老鼠体内增加，NKG2D在这种实验模型中早期炎症的发生发展中起着重要作用，Perera等〔38〕研究非经典MHCⅠ类分子在IBD肠道上皮细胞的表达情况，诸多证据表明IBD的肠黏膜免疫反应失调，其中涉及炎性细胞的异常激活和(或)特异性调节性T细胞的激活失败。Lü等〔39〕体外研究发现UC患者中肠黏膜MICA mRNA表达升高，MICA*A5.1基因型UC患者表达于肠黏膜上皮细胞的MICA*A5.1蛋白易脱落，形成可溶性MICA分子，导致肠黏膜上皮细胞表达下降，从而减弱NK细胞，γδT细胞和CD8+T细胞等对其的识别和清除，扰乱正常的免疫监视和免疫调节等。同时sMICA分子可能在肠黏膜局部持续性刺激肠黏膜内淋巴细胞和其他免疫调节性细胞等，从而使局部的免疫反应亢进，导致 UC的发生。Park等〔40〕研究转基因(T3b-MICA Tg)老鼠，选择性地在小肠表达MICA分子，结果显示在肠道上皮细胞有TCRαβ CD4 CD8αα双阳性黏膜上皮淋巴细胞。Allez等〔41〕研究显示CD和UC患者肠上皮MICA表达上调，MICA可能与肠上皮细胞和肠黏膜T细胞表达的NKG2D受体结合，杀伤表达MICA的靶细胞，CD4+NKG2D+细胞毒性T细胞导致炎症的发生以致肠道黏膜的损伤，比CD患者的低。在UC、CD和正常对照组中外周血和肠黏膜CD8+T细胞表面NKG2D的表达没有差别;但是在CD外周血和肠黏膜患者中CD4+NKG2D+T细胞较UC和正常组的高，提示NKG2D-MICA介导的细胞毒效应对肠黏膜产生损伤作用，并作为效应性T细胞产生高水平的IFN-γ，CD4+NKG2D+T细胞能够杀伤外源性表达MICA分子靶目标，但是UC无这种效应。MICA基因是如何影响UC的起病及发病过程，国内外在这方面的报道也很少。

2 巨细胞病毒感染与UC的相关性

人巨细胞病毒(HCMV)属于疱疹病毒家族，它能在人体内建立起一个终身持久的潜伏性感染，并且间歇不断复发，当人免疫力强盛时潜伏而不显，但是在人体免疫力低下时，可出现复发感染，造成严重损伤，在西方人群中感染率为70% ～80%〔42〕。虽然病毒感染大多处于潜伏状态，但增加了免疫力缺乏的个体包括手术移植的宿主个体的发病率和死亡率。体外研究表明，HCMV能够诱导大量MHC-Ⅰ类分子MICA和MICB的表达，这些蛋白都是NKG2D受体的配体，NKG2D受体表达在NK细胞，CD8+T细胞，γδT细胞表面，MICA是细胞毒作用、细胞增殖、细胞因子分泌的共刺激分子，MICA蛋白表达在肠道上皮细胞和血管上皮细胞表面，成纤维细胞，但是不在外周血T和B细胞表面表达〔43，44〕，是一种应激性蛋白，在热休克，射线，或者感染的情况下或者某些肿瘤细胞表面表达。HCMV编码的蛋白结合细胞的MICB、ULBP1和ULBP2阻止了这些蛋白表达于细胞表面，这样阻止了这些蛋白结合激活性受体NKG2D产生NK细胞激活信号，但是MICA不与UL16蛋白结合〔45〕，还是表达于细胞表面，说明MICA在巨细胞病毒感染后发挥着重要作用，但MICA在HCMV感染中的机制尚未明确。

HCMV感染与IBD等慢性疾病之间的相关性研究日益增多〔46，47〕，HCMV侵入机体后常呈无症状性感染，可能是机体免疫功能受抑制时可被激活，但是HCMV的具体发病机制还不明确，需进一步研究。胃肠道巨细胞病毒感染疾病可能在免疫功能正常人群中发生，但是大部分是有免疫缺陷综合征或者器官移植，癌症化疗后和激素治疗病人，在胃肠道巨细胞病毒感染疾病，总的发病率和病理损害的部位根据宿主免疫缺陷的原因产生，溃疡、边缘性磨损、黏膜下出血是肉眼可见的病理损害，然而与巨细胞病毒感染有关的肠道病理损害非常复杂并且机制仍然不清楚。最近研究〔48〕报道IBD病人巨细胞病毒感染，IBD病人中特别是UC病人，HCMV复发感染较常见，可能是因为这些病人经常使用免疫抑制剂，复发感染能够引起严重溃疡，再者HCMV能够诱导重度UC，甚至一些没有接受过免疫抑制剂治疗的UC病人。然而HCMV在IBD病人肠道炎症的发病意义至今不明确，有报道〔49〕HCMV在激发炎症过程中起到关键作用，有研究〔50〕报道CMV在肠道中无发病作用。

我国巨细胞病毒感染率比较高并与许多疾病相关，但在IBD中的研究较少。遗传易感性作为IBD发病的内因基础已经比较明确，有学者〔51〕研究认为某些病毒的感染也是IBD发病的环境因素之一，可能是遗传背景的个体在CMV感染后导致了免疫耐受的破坏而引起自身免疫反应而触发IBD。国外研究显示在免疫缺陷综合征患者中MICA*A5.1感染HMCV的危险度增加〔52〕。本课题组前期研究〔53〕表明 MICA*A5.1与UC相关，MICA和MICB在肠道上皮中表达增加，NK细胞MICA的受体NKG2D表达增加，并发现患者血清中可溶性MICA分子较正常人高，UC患者外周血NK细胞表达NKG2D及胞内INF-γ的量均高于正常对照者。这些是否因为肠道病毒感染所致，在我国巨细胞病毒感染是否是UC的发病原因，是否具有MICA*A5.1基因型的患者在病毒感染和基因易感的情况下引起肠道炎症的发生。

IBD的发病机制与遗传和环境等多种因素导致的免疫应答异常有关，特别是 CD4+T细胞的机制研究较多，但在NKG2D受体的激活上研究较少。NKG2D受体在NK细胞、δγT细胞、CD8+T细胞以及激活的CD4+T细胞表面都有表达，但是MICA是如何影响肠道炎症的发生发展的;MICA分子是与哪种炎性细胞相互作用产生细胞毒性作用从而产生对肠道黏膜的损伤破坏作用?NKG2D-MICA介导的炎症在IBD中的免疫过程中的信号转导通路又是如何;NKG2D及配体相互作用是直接的细胞毒性作用还是作为共刺激分子激活T细胞发挥细胞毒性作用，发挥作用的信号传导通路是什么，这些都需要做进一步的研究。

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