抗菌药耐药性预测框架的构成要素

郝海红，黄玲利，王玉莲，戴梦红，程古月，刘振利，袁宗辉

(国家兽药残留基准实验室(华中农业大学)/农业部食品兽药残留检测重点实验室，武汉 430070)

抗菌药在有效治疗病原菌感染的同时，会导致细菌产生特定的耐药性，在特定条件下，耐药菌优胜劣汰，适应性较强的耐药菌得以生长繁殖并在宿主和环境中传播流行。在这个过程中抗菌药的使用是源头，不同抗菌药将导致不同的耐药性后果;细菌耐药性产生和传播机制是基础，不同耐药机制会对耐药菌的存在和传播造成不同的影响;宿主和环境是影响耐药菌传播和流行的重要因素，不同宿主和环境将决定耐药菌流行的规模和趋势［1］。因此，把握“抗菌药－耐药菌－产生－适应－传播－流行”过程中的关键因素，便有望对抗菌药耐药性进行预测，为新药上市前的安全性评价提供依据，为细菌耐药性风险评估和抗菌药耐药性监管措施的制定提供参考，最终为公共卫生健康服务［2］。本文从抗菌药的作用、细菌耐药性的产生、耐药菌的适应性、耐药性的转移、耐药性的分子流行性监测等关键环节，分别论述抗菌药耐药性预测的构成要素，从分子机理层面为构建抗菌药耐药性预测模型奠定基础。

1 抗菌药的作用

抗菌药作用是细菌耐药性产生的第一步，其中药物作用机制、药物浓度、作用时间等是影响其耐药性选择作用的关键因素。

科学界长期致力于药物的作用机制研究，探寻药物的结构和药物作用靶位。根据药物的作用靶位不同，将药物分成:(1)抑制G+菌细胞壁合成的药物，如青霉素类、头孢菌素、杆菌肽等;(2)增加细菌胞浆膜通透性的药物，如多肽类、多烯类;(3)抑制细菌蛋白质合成的药物，如氨基糖苷类、四环素类、氯霉素类(30S)、大环内酯类和林可胺类(50S);(4)抑制细菌核酸DNA的合成的药物，如喹诺酮类;(5)影响叶酸合成的药物，如磺胺类、抗菌增效剂。药物的结构与作用机制的特异性与细菌耐药性产生密不可分。因此抗菌药的结构和作用机制的特异性必然成为细菌耐药性预测的重要参数。

然而Nature和Science刊发的最新研究结果显示抗菌药对细菌的杀灭机制具有一定的共性，即抗生素与细菌靶位(包括DNA、蛋白和细胞壁等靶位)结合以后，细菌会先通过代谢负反馈过程激活电子转运链，产生超氧自由基，再通过铁硫蛋白作用产生羟自由基，自由基破坏细菌的脂质、DNA或蛋白质导致细菌死亡［3］。在这个自由基依赖的细菌氧化损伤死亡通路(radical based oxidative damage cell death pathway)中，抗菌药作用下细菌活性氧(Reactive oxygen species，ROS)的产生似乎是决定细菌死亡或产生耐药得以生存的关键因素。因此，在抗菌药作用下，ROS的产生便也可以考虑作为耐药性预测的重要参数。

传统的新型抗菌药耐药性预测大多是基于药物系列诱导实验而进行的，即用一系列不同浓度的药物对细菌进行诱导，在不同时间分析耐药菌的产生，确定抗菌药与细菌耐药性产生的量效和时效关系。细菌存在一个耐药突变选择窗(mutant selection window，MSW)，即细菌易发生耐药突变对应的抗菌药浓度范围。近年来的研究发现药物的药代动力学(pharmacokinetics，PK)和药效学(pharmacodynamics，PD)参数(AUC/MIC)与这种耐药突变选择之间是一种不规则的倒“U”型关系，在较低的AUC/MIC药物暴露下，耐药突变株大量产生并稳定保持，AUC/MIC足够大时，耐药菌的产生才能被充分遏制。与传统的体外诱导实验相比，药代动力学和药效学同步模型综合了PK与PD参数，并将两个动力学过程按时间同步进行，可更真实反映药物给药剂量对应的时间一效应过程，预测特定抗菌药用药方案可能导致细菌耐药性产生的风险［4］。

2 耐药性的产生

在宏观细菌领域中，细菌本身存在形形色色的潜在耐药突变或耐药基因，这些潜在的因子在一定的药物选择和环境作用下才凸显出耐药性。目前已经发现的细菌耐药性的机制大致包括:(1)细菌产生灭活酶或钝化酶以破坏抗生素的分子结构并使其失效，如β－内酰胺酶、氨基糖苷类钝化酶、氯霉素乙酰转移酶等。(2)靶位修饰或改变。如氟喹诺酮类药物耐药相关的拓扑异构酶基因gyrA和parC的突变，或者细菌产生甲基化酶、甲基转移酶等修饰或取代靶位。(3)膜通透性和外排能力改变。细菌通过改变外膜蛋白结构或调控外排泵表达水平来阻碍抗生素的渗透和泵出［5］。但是这些耐药性产生机制远不足以解释和预测细菌耐药性。许多潜在的耐药突变和耐药因子尚待发掘。

在细菌群体生态环境中，细菌可能通过多种机制来产生耐药性。最新研究发现:(1)在抗生素压力下，细菌群体通过代谢物分享来保证群体耐药。在液态的群体培养环境中，含有突变的高水平耐药菌可以分泌Indole(L－tryptophan的分解代谢物)到培养基中，以便于低水平耐药菌共享，保持群体的耐药性。在固体培养基中，某些细菌克隆还可能散发气态胺(gaseous ammonia，L－aspartate分解产物)，增加细菌的多聚胺浓度，调节细菌膜通透性、减低药物对细菌的氧化应激。(2)在抗生素压力下，细菌群体还可能通过亚生存途径(subsistence pathways)，进入休眠状态，产生对药物的耐受性(tolerance)［6－7］。在营养缺乏情况下，细菌通过饥饿信号反应(starvation－signaling stringent response，SR)减缓生长或形成生物被膜，从而介导细菌对抗生素的耐受性;灭活此保护机制则可以从不同层面敏化细菌生物被膜对不同类药物的反应，提高抗生素作用效果［8］。体内外实验证明，添加特定代谢物(fructose，mannitol或glucose)到细菌外环境中，可以为细菌提供质子原动力(proton－motive force)激活耐受菌的核心物质代谢和呼吸、激发细菌对代谢物或药物的吸收、提高药物对细菌的敏感性。(3)在抗生素压力下，细菌在一个复杂的微生态环境中，通过其他多种机制实现生存，比如土壤细菌可以把抗生素作为主要碳源吞食，将抗生素从环境中清除;有些细菌可以利用环境中的一些天然小分子(如microfluidic)获得耐药性;有些细菌可以感知环境中抗生素浓度梯度，逃避到相对低浓度区域进行快速繁殖和生存而获得耐药性。

鉴于大多数抗生素生产微生物本身对多种抗生素耐药，现代研究提出用“耐药组学(resistome)”的概念来涵盖所有环境中存在的抗菌药耐药基因，即在环境中天然存在许多潜在的耐药因子［9－11］。利用现代宏基因组学、生物信息学以及转座子突变体库构建等手段尽可能多地发掘病原生态环境中潜在的耐药突变、耐药因子、耐药性产生信号机制等，则可以帮助人们把握细菌耐药性产生的潜在性，预测抗菌药耐药性可能的发生方向。

3 耐药菌的适应性

细菌在获取耐药性同时，其自身的生理特性(毒力和适应性等)也随之改变。适应性是指耐药菌在没有药物选择压力的情况下，对不同环境的适应能力，包括生长力，定植力，侵袭力、致病力等，主要是相对敏感菌的竞争力。耐药菌的相对适应性(relative fitness)是决定耐药菌在宿主或环境中存在、扩散、转移和流行的生命基础。不同细菌，不同耐药类型，不同环境，这种适应性变化也有差异。有些耐药细菌表现适应性代价(fitness－cost);有些则表现出适应性增强(enhanced fitness)，如氟喹诺酮耐药弯曲杆菌［12］;某些具有适应性代价的耐药菌，在长期的进化过程中，可能会产生相应的代偿性变化(compensatory mutation)来缓解其适应性代价，增强其自身竞争力［13］。

耐药菌的适应性是相对的、有条件的，受到耐药产生类型、耐药菌自身进化机制和耐药菌所处环境等的影响。Gagneux等［14］在Science上的一篇关于《结核分支杆菌多重耐药性与竞争生长力》文章中对不同基因背景、不同的耐药突变点的耐药菌进行竞争生长力测定，发现耐药菌的竞争生长力受细菌的基因背景和所产生的突变点的双重影响。他们同时还将实验所获得的竞争生长力的数据同临床耐药菌分子流行病学调查结果进行比对，发现相对适应性的高低与临床分子流行情况的频繁程度呈正相关。耐药菌的适应性并不是一成不变的，引起适应性代价的细菌，在长期不接触药物的情况下，通过其自身的进化机制，还可能产生其他方式的突变(compensatorymutations)以补偿这种适应性代价，从而使细菌不仅可以保持其耐药性，而且恢复其适应性和生长力［15－18］。但是，这种适应性补偿性进化突变的产生受到环境的极大影响，不同的环境，其补偿性突变也不同。Bjorkman等［19］在Science一篇文章《环境对于补偿性突变的影响》中报道同一株耐药沙门氏菌在LB肉汤和在小鼠体内进化产生的补偿性突变是不同的，并且他们还发现体外适应性测定方法结果，即通过体外竞争生长力试验所测定的相对适应性(relative fitness)数值与体内所测定的相对适应性的结果存在差异，故对耐药菌和耐药补偿菌的相对适应性测定需要综合体外和体内相对适应性的结果进行综合分析。

细菌的适应性可以在培养基或动物模型中通过相关试验进行测定［12，15，20］，并在测定过程中考虑诸多可变因素，比如耐药突变类型、适应性补偿变化和环境等因素，建立相应的数学模型，预测特定的耐药菌未来的流行趋势。

4 耐药性的转移

耐药菌可能通过垂直克隆进行传播和转移。比如从农场、养殖人员与养殖动物体分离的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)具有相同的分子分型，提示这些MRSA超级细菌可能通过直接的接触传播，从动物(猪、牛和其他宠物等)传染给人［21－23］。

许多耐药因子都可通过可移动元件(mobile genetic elements，MGEs)进行传播和转移。这些MGE包括插入序列、噬菌体、质粒、转座子、基因岛、毒力岛和染色体盒等。临床中分离的G+菌，如肠球菌、金黄色葡萄球菌、链球菌等都表现出多重耐药性，因为他们可以从可移动元件上获取外源耐药基因，通过不断整合外源耐药基因而获得多重耐药性［24］。抗性基因可通过水平转移(Lateral Gene Transfer，LGT)在细菌间共享，使得耐药性因子可以跨越菌属的界限，在畜禽、环境和人类之间广泛传播［25］。近年来的报道显示，人肠道微生态中的一些不可培养细菌可能是耐药基因的储存库，但其贮存的耐药因子是否可以转移给病原菌取决于供体和受体的进化距离［26］。有报道指出，在环境和人肠道微生态中，MGE是耐药基因的载体，具有一定的生态风险［27］。MGE的宿主范围越广，其推动耐药因子转移的风险就越大，但是MGE的分布往往具有一定的特异性，特定细菌往往独拥特定的MGE，并且在一定的“基因交换细菌团体(genetic exchange bacterial commmities)”中，MGE会严格控制摄入的基因成分以保持其代谢或共耐药性［28－29］。因此，细菌的“耐药组”是否可能被 MGE捕获，决定了特定耐药基因的传播风险。然而，目前MGE相关的风险预测几乎未见报道，毕竟当前预测细菌“耐药组”被MGE捕获的可能性的方法，特别是定量的风险评估方法还尚待研究。目前，仅可以通过实验测定特定耐药基因所定位的基因交换团体的大小和结构对MGE的捕获能力和耐药基因的获取风险进行预测［30］。

5 耐药性的流行监测

从细菌的耐药发展史看，耐药菌出现最多只需2年时间。比如1960年，甲氧西林被开发用于临床，1961年耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)被发现，并迅速传播，到20世纪90年代，多重耐药高毒力的耐甲氧西林的金葡菌广泛流行，目前几乎无药可医。在碳青霉烯类药物被开发用于临床后，2010年8月11日Lancet Infect Dis刊发了产Ⅰ型新德里金属β－内酰胺酶(new delhimetallo－lactamase 1，NDM－1)泛耐药肠杆科细菌，简称NDM－1细菌，此“超级细菌”对除替加环素和黏菌素外的药物几乎“刀枪不如”［31］。随后NDM－1菌也在医院外的社区人群中被分离到［32］。并且农牧业中抗菌药的使用很可能导致动物耐药菌增加，这些动物源耐药菌也很可能通过食物链途径传播，继而导致人感染耐药菌比例增加，比如氟喹诺酮耐药弯曲杆菌。美国农业部和动物卫生部在批准家禽使用氟喹诺酮类药物后3年内，美国国内医院发现人类感染耐氟喹诺酮类弯曲杆菌肠道疾病增加、患者病程加长和病情复杂，使用氟喹诺酮类药效下降或者无效［33］。1976－1980年间，糖肽类药物阿伏帕星在欧洲作为促生长剂被广泛用于食品动物，后来发现阿伏帕星在食品动物的使用可能导致万古霉素耐药肠球菌的产生和流行，因此1998年该药被欧洲国家禁止用于食品动物。

药物在投入使用后，环境中众多因素可能导致其耐药性流行。在临床的复杂环境中，特别是要准确、长期和全球性预测抗菌药耐药性产生、耐药基因捕获、新耐药基因建立、耐药基因在细菌群体中的传播和进化，是非常困难的，因为其中的变量太多，复杂性难以掌控。在目前的技术和科学水平上，只能在药物应用初期对潜在的耐药成分进行分子流行性调查，并在期间考虑细菌群体环境和抗菌药的尊者作用等，应用高通量的宏基因组学方法筛选药物作用下细菌群体可能产生的耐药突变、获取的耐药基因以及MGE流行情况，以此提供可以固定的耐药性预测线索［34－35］。多角度的分子流行病学调查策略可以全面分析耐药基因以及耐药基因的交换和整合风险，为抗菌药耐药性预测模型和定量风险评估方法的建立奠定基础。

6 展望

抗菌药的耐药性预测框架涵盖内容广，工程复杂，需要在全面探索抗菌药作用机制和细菌耐药性产生适应和传播机制的基础上，应用现代组学和系统生物学思路，挖掘细菌潜在的“耐药组”，预测药物作用下细菌耐药性产生可能性，评价特定耐药性对应的适应性和代偿性变化，多方位测定特定耐药基因被可移动成分的捕获能力，评定特定耐药基因在环境中的转移和扩散风险。此外，在耐药性预测框架中，除耐药菌适应性评定方法已相对成熟外，其他很多预测内容尚没有标准化的定量方法可参考，并且环境中复杂的因素更增加了抗菌药耐药性预测的难度。目前，抗菌药耐药性预测已经成为欧盟框架项目中的重点项目，我国虽然在耐药性预测框架的各个环节已经逐步开展了相应的研究和监测工作，但是缺乏总体规划和系统研究。抗菌药耐药性预测道路漫长，任重而道远。

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