乌苏里貉染色体核型及G 带分析1)

王 星 白秀娟

(辽东学院，丹东，118003) (东北农业大学)

貉(Nyctereutes procyonoides)是珍贵的毛皮动物，与狐、水貂并称为毛皮动物产业的“三大支柱”，是重要的制裘原料，我国貉的饲养量目前居世界首位。貉属于犬科动物，中国貉(Nyctereutes procyonoides procyonoides Gray)和日本貉(Nyctereutes procyonoides νiνerrinus Temminck)是公认的貉的2 个亚种，染色体有不同的数目和形态［1］。乌苏里貉(Nyctereutes procyonoides Ussuriansis)是中国貉的地理亚种，是我国饲养的主要品种［2］。染色体核型、带型分析是确定动物分类地位和进行遗传特性研究的重要方法和内容。研究乌苏里貉染色体的核型、带型，为犬科动物分类、染色体多态性及进化提供依据，也为基因的染色体定位奠定遗传学研究基础。

1 材料与方法

试验动物:成年、健康雄性乌苏里貉2 只，取自东北农业大学乌苏里貉饲养基地，为野生乌苏里貉与家养乌苏里貉的杂交后代。

试剂:胎牛血清(Sigma)，RPMI Medium 1640(Gibco)，PHA、秋水仙素、胰蛋白酶均为国产分析纯，购自哈尔滨伊事达生物有限公司。

仪器:生物显微镜(OLYMPUS B ×51);超净操作台(苏州净化设备有限公司);台式离心机(上海安亭科学仪器厂);电热恒温水浴锅(北京市长风仪器仪表厂);超纯水净化装置(Milli - Q，ZMQS50F01);数码相机(Nikon COOLPIX 4500)。

细胞培养基:RPMI1640 培养液4 mL，胎牛血清1 mL，PHA2.5 mg，青霉素500 IU，链霉素500 IU，抽滤灭菌，分装于25 mL 的培养瓶，置于冰箱中冷藏保存备用，每瓶综合培养基约5 mL。胎牛血清解冻后56 ℃灭活30 min，1 mL/管分装后储于-20 ℃备用。

PBS 缓冲液:按V(0.2 mol/L Na2HPO4)∶ V(0.2 mol/L NaH2PO4)=38 ∶ 62 的比例配制pH =7. 0 PBS 缓冲液。高压灭菌，分装后储于4 ℃备用。

KCl 低渗溶液(0.075 mol/L):将5.592 g KCl用蒸馏水溶解后定容至1 L。

卡诺氏固定液:V(甲醇)∶ V(冰乙酸)=3∶ 1，现用现配。

Giemsa 原液:称取Giemsa 染色素1.0 g 倒入研钵，量取甘油66 mL，加少许于研钵中充分研磨，加全部甘油后，置56 ℃2 h，期间每隔20 min 搅动1次，待冷却后加66 mL 甲醇，搅匀后倒入棕色试剂瓶，室温保存20 d 后即可使用。

秋水仙素:用PBS(pH =7.0)配制成浓度为20 g/L 的原液，4 ℃保存备用。

乌苏里貉血液淋巴细胞培养:用装有抗凝剂(肝素钠)的一次性5 mL 注射器，从乌苏里貉前肢采血1 ～5 mL。将血样迅速带回实验室，并无菌条件下在每个培养瓶内滴入0.5 ～1.0 mL 抗凝血，封严瓶口，将培养瓶置于恒温培养箱内37 ℃培养72 h，每隔12 h 轻轻摇晃一次。在培养结束前4 h 加入秋水仙素。加入秋水仙素终浓度为0.4 mg/L，然后继续培养。观测由培养瓶中的培养细胞制备的染色体标本片，并计算各自的有丝分裂指数。

乌苏里貉染色体标本的制备:1 000 r/min 室温离心10 min，弃上清。加预热的KCl 低渗液(37 ℃)9 mL，于37 ℃水浴30 min。加约1 mL 卡诺氏固定液预固定，吸打均匀，2 000 r/min 室温离心10 min。弃上清，用9 mL 固定液于室温固定20 min。2 000 r/min，离心10 min，弃上清。用9 mL 固定液第2 次固定，室温20 min。此时可放入4 ℃保存。2 000 r/min，离心10 min，弃上清。用9 mL 固定液进行第3次固定，室温20 min。2 000 r/min 室温离心10 min，弃上清，视淋巴细胞多少用适量(0.2 ～0.5 mL)固定液重悬细胞。滴2 ～4 滴细胞悬液于-20 ℃预冷的载玻片上。室温放置，空气干燥。

乌苏里貉染色体核型分析:用新配制的Giemsa染色液(V(原液)∶ V(PBS)=1 ∶ 9)染色20 ～30 min，蒸馏水冲洗，空气干燥。用显微镜观察，选择分散程度良好、无丢失、背景清晰的分裂相进行显微照相，打印，经剪切配对，用游标卡尺测量，根据测量结果计算出乌苏里貉染色体的3 个参数(臂比、着丝粒指数、相对长度)，并进行剪贴、配对和编号。臂比=长臂长度/短臂长度。着丝粒指数=(短臂长度/染色体长度)×100%。相对长度=(某一染色体长度/(全部常染色体长度+X 染色体长度))×100%。

貉染色体G 带分析:选取制作好的染色体玻片标本，空气干燥，老化3 ～5 d。在0.25%胰蛋白酶工作液内处理10 ～20 s。在PBS 缓冲液内漂洗30 s×3次。姬姆萨磷酸缓冲液(1∶ 9)内染色20 ～30 min 分钟。蒸馏水冲洗，空气干燥。镜检染色体G 带分裂相。选择分散程度良好、无丢失、背景清晰的分裂相进行显微照相，打印，并将各同源染色体配对。

2 结果与分析

2.1 乌苏里貉染色体核型分析

观察了30 个细胞分裂中期染色体，绝大多数细胞的二倍体常染色体数目为52，常染色体可分为两组:一组是5 对具亚中部着丝粒染色体(SM)，一组是21 对具端着丝粒的染色体(T)(表1)。两组染色体没有特征性标志，其长度递次减小。本研究中染色体标本中发现B 染色体，多为2 个，数目不等。

乌苏里貉染色体计数结果表明2n =54 +2B，常染色体中有10 条双臂染色体和44 条单臂染色体，Y 染色体是很小的端着丝点染色体，X 染色体是中间着丝点染色体(见图1)。常染色体按同源染色体配对，然后再依染色体大小递减排列，按照中部、亚中部和端部着丝点染色体从长到短排列，测量每个细胞的染色体长度，计算出其相对长度，臂比值和着丝粒指数(见表1)，根据以上结果进行配对，并进行核型分析(见图1)。

表1 染色体的相对长度、着丝粒指数和臂比

2.2 乌苏里貉染色体G 带分析

在染色体G 带分析中，G 带数量与染色体长度相关，G 带的质量与酶的浓度及消化时间长短有关(图2)。秋水仙素可以增加中期分裂相的比例，还可以使中期染色体缩短和使染色体单体更加分散，从而使染色体轮廓更加清晰。但秋水仙素浓度过高或处理时间过长，则有可能导致标本中的分裂相增多，染色体收缩过短，难于计数与分析。因此选择适当的秋水仙素浓度和作用时间，对染色体标本的制备来说尤为重要。本试验中，貉淋巴细胞在0. 4 mg/L 和4 h 的作用时间下，即可获得较高的标准分裂相的比例和分裂指数。胰蛋白酶消化是染色体显带中比较关键的一步，把握准胰蛋白酶消化的时间极其重要。消化时间长，则染色体的带消化过度，不显带;如果消化时间过短，染色后染色体的深、浅带反差不大。不同厂家产胰蛋白酶的活性不同，在试验时一定要摸索。本试验中，在0.25%胰蛋白酶工作液内处理10 ～20 s 可以获得较满意效果。

图1 乌苏里貉染色体核型

图2 乌苏里貉染色体G 带分析图

3 讨论

乌苏里貉常染色体可分为两组:一组是5 对具亚中部着丝粒染色体，一组是21 对具端着丝粒的染色体。本研究中个别标本中发现B 染色体，多为2个，数目不等。研究报道芬兰貉有3 个B 染色体［3］，中国貉也有发现B 染色体的报道［1］。

染色体组型分析与郭健民、王宗仁等的报道基本一致［4-5］。但在本研究中，X 染色体为具中间着丝点的中等大小染色体。王宗仁、郭健民等研究认为貉X 性染色体是具端着丝粒的染色体，与本试验结果不同。在本试验中，从X 染色体来看，与Mäkinen 等［6］、Pieńkowska 等［3］、Nie 等［1］的研究结果类似。郭健民所用的貉捕于秦岭，王宗仁所用貉捕于北京，Mäkinen 用的貉取自芬兰和日本，本次试验的选用的貉为黑龙江乌苏里貉，为家养和野生貉的杂交后代，因此，可能是中国貉不同的地理亚种引起结果不完全一致。在20 世纪40年代，日本衣川雄曾将中国貉和朝鲜貉混分成7 个亚种:乌苏里貉、朝鲜貉、阿穆尔貉、江西貉、闽越貉、湖北貉、云南貉［2］。不同亚种及地理亚种间可能存在高频率的个体内染色体数的多态性和X 染色体的形态变异。

食肉动物是目前研究物种染色体进化的最佳选择，它们同属于哺乳动物并且有相似的基因组结构，即高度重排、染色体核型高度保守。他们祖先有一致的染色体组型(ACK)，应该为2n =42［7］。在古老的犬科的进化过程中存在着激烈的基因组重排。大约在3 500 ～4 500 万年的食肉目动物演变过程中，食肉目比任何其他物种发生得更广泛，至少有67 个重排发生。在1 000 万年前就有现存的犬科动物，染色体核型重排的演变也非常广泛，尤其是狐和貉。日本貉与食肉目祖先核型相比，染色体组型至少发生22 次重排［8］。乌苏里貉X 染色体形态差异是否是由于重排引起的还有待于进一步证明。

1929年，Minouchi 报道了日本貉二倍体染色体数目为2n=38 +4B (包括4 个B 染色体)，这个结果后来被Todd 证实［9］。Mäkinen［6］及Smith［10］等报道了芬兰貉的染色体核型为2n =56，包括5 对近端着丝粒和21 对端着丝粒的常染色体。X 染色体具中间着丝点，Y 染色体小中间着丝点。B 染色体为中等大小，具近端着丝粒［6］。日本貉、芬兰貉和中国貉在染色体组型上的差异，充分证明了貉的染色体数目的多态性和X 染色体的形态变异的多样性。

貉原生于西伯利亚东部，日本，中国和中南半岛北部，在1928—1958年期间，大约有10 万只貉被引进到俄国西部，包括高加索、哈撒克斯坦、西伯利亚等地区［6］。后来又从苏联的欧洲部分扩散到斯堪的纳维亚(半岛)和欧洲中部，目前已经是芬兰主要饲养的毛皮动物之一［11］。本次研究结果表明，乌苏里貉与芬兰貉X 染色体形态相似，5 对具亚中部着丝粒染色体G 带带型相似程度较高［6］，与Nie 等研究中国貉染色体G 带相似程度更高［1］(图3)，乌苏里貉与芬兰貉可能有较近的亲缘关系。日本貉从分类上属于貉的一个亚种，芬兰貉是属于引进物种，与中国貉的亲缘有关系还有待于进一步验证。

研究不同亚种以及中国貉不同的地理亚种的貉在染色体上的微细差异，有助于了解貉在体型、毛被颜色与密度等方面在进化过程中形成的明显差异。通过对貉染色体形态、结构的研究，有助于了解貉起源和进化历程，可以为生物的分类和系统演化、亲缘种的鉴定、群落结构分析等问题的探讨提供细胞遗传学依据。

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［2］ 白秀娟. 养貉手册［M］. 北京:中国农业大学出版社，2007:2 -3.

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