落叶松毛虫SOD 和CAT 对6 种农药的敏感性比较1)

刘哲强 焦 玥 王志英 邹传山

(东北林业大学，哈尔滨，150040)

落叶松毛虫(Dendrolimus superans (Butler))又称西伯利亚松毛虫，隶属鳞翅目(Lepidoptera)枯叶蛾科(Lasiocampidae)。国内分布于华北、东北及新疆北部，是我国东北林区的重要害虫，主要危害落叶松(Larix spp.)、红松(Pinus koraiensis)、油松(P.tabulaeformis)、樟子松(P. sylvestris var. mongolica)、云杉(Picea asperata)、冷杉(Abies fabric)等针叶树种。该虫暴发时吃光树木针叶，形似火烧，甚至使松树枯死［1］。化学防治能迅速降低虫口密度，控制其传播与蔓延，达到最佳控制效果，一直是防治落叶松毛虫的有效措施之一。超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)为昆虫的重要保护酶。SOD 能将有害的超氧自由基转化为过氧化氢，CAT 能将过氧化氢分解为水。因此，SOD 和CAT 可使细胞内自由基的产生与清除维持一种动态平衡，以防止自由基毒害［2］。目前，关于落叶松毛虫SOD 和CAT 的研究尚未见报道。笔者测定了生产防治中常用的6 种农药对落叶松毛虫离体和活体SOD 和CAT 活性的影响，研究了落叶松毛虫在农药胁迫下体内的生理变化，为有效防治落叶松毛虫提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫

落叶松毛虫幼虫于2009年6月采自内蒙古自治区克什克腾旗芝瑞镇落叶松人工林，并于(25 ±1)℃，光照周期为14 h 光照、10 h 黑暗，相对湿度75%的条件下用兴安落叶松松针进行室内人工饲养。

1.2 供试试剂及农药

甲硫氨酸(Met)、氮蓝四唑(NBT)、核黄素(VB2)、苯基硫脲(N－phenylthiourea)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、乙二胺四乙酸(EDTA)、考马斯亮蓝G －250 等均购于SIGMA 公司;磷酸钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、丙酮、三氯乙酸、过氧化氢和牛血清蛋白均为分析纯。供试农药有25%灭幼脲(通化农药化工股份有限公司)、1.2%阿维菌素(黑龙江平山林业制药厂)、40%辛硫磷(山东胜邦鲁南农药有限公司)、2.5%高效氯氟氰菊酯(黑龙江平山林业制药厂)、80%敌敌畏(山东高密市绿洲化工有限公司)、2.5%高效氯氰菊酯(山东大成农药股份有限公司)。

1.3 研究方法

酶液的制备:取5 ～6 头落叶松毛虫6 龄幼虫，清除食道内杂质后用0.1 mol·L－1pH 7.5 的磷酸缓冲液(PBS)清洗体表，置于预冷的研钵中，加入10 mL 预冷PBS 缓冲液，于4 ℃、8 000 r·min－1下离心15 min，取上清液于4 ℃、12 000 r·min－1再次离心10 min，取上清液作为酶源。

SOD 活性测定:参照NBT 法［3－4］测定。反应体系中含有80 μmol·L－1核黄素、77 μmol·L－1NBT、13 mmol·L－1MET、0.1 mmol·L－1EDTA 和50 μL酶液。于4 000 lx 下光照10 min 后遮光停止反应，测定OD560，并测定酶液的蛋白质含量，以NBT 被抑制50%为一个活性单位(U)，酶活性以U·min－1·mg－1表示，每组3 次重复。

CAT 活性测定:CAT 活性测定参照张友军等的方法［5］。反应体系含有0. 1 mol·L－1pH7. 0 的PBS、0.08% H2O2和50 μL 酶液，测定OD240，每30 S记数一次，共记录3 min，计算OD240每分钟的变化值。同时测定酶液的蛋白质含量，OD240每减小0.1定为一个酶活单位(U)，酶活性以U·min－1·mg－1表示，每处理3 次重复。

离体SOD 活性的抑制测定:分别将6 种农药配制成0.01、0.05、0.10、0.50、1.00 g·L－1。测定方法同SOD 活性测定。总反应体积3.65 mL，3.00 mL反应液加入0.05 mL 农药、0. 10 mL 稀释酶液和0.50 mL VB2后于30 ℃、4 000 lx 下光照10 min，测定OD560，同时设定对照组，每处理3 次重复。

离体CAT 活性的抑制测定:测定方法同CAT活性测定。总反应体积3.25 mL，3.00 mL 反应液加入0.05 mL 农药和0.20 mL 稀释酶液后，测定OD240每分钟的变化值，同时设定对照组，每组3 次重复。

活体SOD 和CAT 活性的测定:分别将6 种农药配成0.001 g·L－1低质量浓度，采用点滴法处理落叶松毛虫6 龄幼虫，点滴剂量为1 μL，分别处理12、48、72 h 后挑取活泼幼虫用于酶活性测定，同时以点滴蒸馏水处理为对照。

蛋白质含量测定:测定参照Bradford 的考马斯亮蓝G－250 法［6］。

数据统计分析:试验数据用平均值±标准差表示，并用Excel 2003 和SPSS 18.0 统计软件进行数据分析;酶活性抑制率=(对照活性－残留活性)/对照活性×100%。以杀虫剂浓度的负对数值为横坐标，抑制率为纵坐标计算线性回归方程，并通过线性方程求出IC50。

2 结果与分析

2.1 农药对离体SOD 和CAT 活性的影响

高效氯氰菊酯、阿维菌素、灭幼脲和高效氯氟氰菊酯对离体SOD 均有不同程度的抑制作用，抑制率与质量浓度成正比。而有机磷类农药(辛硫磷和敌敌畏)在低浓度(＜0.10 g·L－1)时表现出对离体SOD 诱导激活作用(见表1)。高效氯氰菊酯、阿维菌素、辛硫磷、敌敌畏、灭幼脲、高效氯氟氰菊酯对体外SOD 抑制中浓度依次为2. 41 × 10－3、2. 32 ×10－2、2.24 ×102、3. 36 ×103、9. 93 ×10－1、1. 53 ×10－2g·L－1;离体SOD 对6 种农药的敏感性由高到低依次为高效氯氰菊酯、高效氯氟氰菊酯、阿维菌素、灭幼脲、辛硫磷、敌敌畏(表2)。Duncan 法多重比较结果表明，阿维菌素(0.01 g·L－1)、敌敌畏(＜0.05 g·L－1)处理SOD 活性与对照差异不显著;高效氯氰菊酯和辛硫磷浓度小于0.05 g·L－1时，处理组SOD 活性显著高于对照，而其余处理组的SOD活性显著小于对照(见表1)。

表1 农药对落叶松毛虫6 龄幼虫离体SOD、CAT 的活性影响 U·min －1·mg －1

6 种农药对落叶松毛虫6 龄幼虫体外CAT 活性均有抑制作用，抑制程度存在明显差异，抑制率与质量浓度成正比(见表1)。高效氯氰菊酯、阿维菌素、辛硫磷、敌敌畏、灭幼脲和高效氯氟氰菊酯对体外CAT 抑制中浓度依次为1.21 ×105、18.32、4.79 ×105、1.36 ×107、0.44、47.92 g·L－1。其离体CAT对6 种农药的敏感性由高到低依次为灭幼脲、阿维菌素、高效氯氟氰菊酯、高效氯氰菊酯、辛硫磷、敌敌畏(见表2)。多重比较结果表明，利用高效氯氰菊酯(≤0.10 g·L－1)、阿维菌素(0.01 g·L－1)及辛硫磷(0.01 g·L－1)处理时，处理组CAT 活性与对照间差异不显著;而其余处理CAT 活性显著低于对照(见表1)。

2.2 农药对体内SOD 和CAT 活性的影响

用0.001 g·L－1的6 种农药处理落叶松幼虫12 h，结果表明，灭幼脲处理组SOD 活性高于对照，但差异不显著，阿维菌素处理组低于对照，但差异也不显著;而其它4 个农药处理组均显著低于对照;其中高效氯氰菊酯处理组SOD 活性最低，仅为对照的0.628 倍;处理48 h，灭幼脲及阿维菌素2 个处理组的SOD 活性均显著低于对照，辛硫磷处理组也低于对照，但差异不显著;高效氯氰菊酯和高效氯氟氰菊酯处理组SOD 活性显著高于对照，敌敌畏处理组也高于对照，但其差异不显著;6 个处理中，灭幼脲处理SOD 活性最低，仅为对照的0.565 倍;高效氯氰菊酯处理SOD 活性最高，为对照的1.441 倍;处理72 h，敌敌畏和阿维菌素处理SOD 活性显著高于对照，分别为对照的1.839、1.798 倍;灭幼脲处理SOD 活性为对照的1.030 倍，但差异不显著;其余3种农药处理组的SOD 活性均低于对照，但与对照差异不显著，其中高效氯氰菊酯处理SOD 活性最低，仅为对照的0.842 倍(见表3)。

表2 农药对离体SOD、CAT 活性的抑制中浓度

表3 农药对落叶松毛虫6 龄幼虫体内SOD、CAT 活性影响 U·min －1·mg －1

6 种农药处理12 h，只有高效氯氟氰菊酯处理组的CAT 活性低于对照，但差异不显著;阿维菌素处理组CAT 活性高于对照，但与对照间差异不显著;而其余处理组的CAT 活性均显著高于对照，其中灭幼脲处理组CAT 活性最高，为对照的1. 539倍;处理48 h，只有高效氯氰菊酯处理组CAT 的活性显著低于对照，仅为对照的0.667 倍;敌敌畏处理组CAT 的活性略高于对照，但其差异不显著;其它处理组CAT 的活性均显著高于对照，其中高效氯氟氰菊酯处理组CAT 活性最高，为对照的1.600 倍;处理72 h，阿维菌素处理组CAT 活性最低且与对照差异显著，仅为对照的0.520 倍;灭幼脲处理CAT活性略高于对照，但差异不显著，其余处理组CAT活性均显著高于对照，其中高效氯氟氰菊酯处理CAT 活性最高，为对照的1.485 倍(见表3)。

3 结论与讨论

昆虫体内的SOD、POD 及CAT 在其生长发育、化学农药渗入、病原微生物侵染以及其他逆境中发挥着清除自由基、保护机体免受或减轻伤害的作用［7－10］。SOD 和CAT 活性与周围环境(温度、湿度、农药胁迫等)及食物等有密切关系。低温促进麦红吸浆虫幼虫(Sitodiplosis mosellana)SOD 和CAT的活力，而高温却导致其活力下降［11］;马尾松毛虫(Dendrolimus punctatus)取食受害新叶后马尾松的CAT 活力上升［12］。此外，SOD 和CAT 活性与农药种类、浓度及处理时间存在必然联系。双齿围沙蚕(Perinereis aibuhitensis)CAT 活性与马拉硫磷的浓度和处理时间存在效应关系［13］;天幕毛虫(Malacosoma neustria testacea)4 龄幼虫离体和活体SOD 比活力大小与高效氯氰菊酯、阿维菌素和辛硫磷的质量浓度有关［14］。

本研究表明，高效氯氰菊酯和高效氯氟氰菊酯对落叶松毛虫6 龄幼虫离体SOD 活性抑制性最强，其IC50分别为2.41 ×10－3、1.53 ×10－2g·L－1。相对而言，敌敌畏和辛硫磷不仅对离体SOD 抑制性最弱，甚至在0.05 g·L－1质量浓度以下时反而表现出对SOD 活性的诱导激活作用;灭幼脲和阿维菌素对CAT 活性的抑制能力大于其余类农药。6 种供试农药的低浓度剂量处理后，均打破了落叶松毛虫6 龄幼虫体内自由基的平衡，并表现出明显的时间效应，其活性变化与外界刺激物相应的强度有关，这是昆虫为维持体内平衡清除自由基的调节过程。在生物体正常的生理条件下，由于体内自由基不断产生的同时也被不断清除，因而未表现出自由基对机体的明显损伤。由于生物体内某些生理作用或生化反应需要O2的参与(如:清除入侵微生物)，由于O2参加反应，致使其机体内自由基不断地产生，这时就需要SOD、CAT 等保护酶之间的协调作用来清除过多的自由基，从而使其体内维持在有利无害、生理性低水平、稳定平衡的自由基浓度［15－16］。由此可见，因农药种类的不同，刺激昆虫体内产生的自由基浓度也有一定差异。落叶松毛虫6 龄幼虫在面对不同农药胁迫时，为维持体内的系统平衡，SOD 和CAT 活性随农药刺激的强弱而变化，这也是昆虫适应逆境及抗药性形成的主要机制之一。

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