牛奶中残留抗生素的快速检测方法研究

刘雪莹

山东省菏泽医学专科学校

1 概述

抗菌药物被广泛应用于治疗养殖动物，有时也被作为生长促进剂使用[1]。这些药物的大量利用必然导致食品中留有残留物。抗菌药物残留物的存在引起了人们对消费者健康的关注。主要考虑对象为：（i）对接触过的个体可能产生的过敏性敏化作用；（ii）抗菌药物残留物甚至在浓度低于最高残留限量时也有可能对人体肠道施加选择性压力；（iii）选择抗药性细菌的可能性。

根据高性能的非侵入性二氧化碳传感器的具体应用情况，人们研发了电化学传感器系统，以可靠、快速、低成本的研究微生物学过程。在本研究中，作者将二氧化碳传感器用于检测和鉴定牛奶中残留的喹诺酮和四环素。这种测量以生成二氧化碳的速率为基础，其中二氧化碳生成的速率与敏感菌生长的抑制有关。本文针对喹诺酮和四环素开展了实验研究，因为人们认为应特别关注牲畜生产中最后使用的这些物质，而且这些物质能够治疗通过食物链把动物源性细菌传播至人体而导致的各种人体感染（包括胃肠道感染）。对喹诺酮和四环素的耐药性会限制许多感染的药物选择。此外，对这两种药物具有耐药性的生物体通常也会对其它类别的抗菌药物产生耐药性。这种情况下，首先必须鉴定在养殖动物中喹诺酮和四环素的使用给公共卫生造成的风险，这有助于研发适合于有效食品管理的分析方法。

2.实验

2.1 材料和试剂

2.1.1 气体标准物质（GRMs）

在传感器标定中使用了浓度分别为348、1253、1745、2881和6600ppm的CO2（产自意大利罗马的SIADSrl）。

2.1.2.微生物

本研究所用的微生物为大肠杆菌ATCC11303。也测试了其它微生物，但是因为大肠杆菌对喹诺酮和四环素比较敏感、繁殖时间短、更重要的是，大肠杆菌不会致病，所以选定了大肠杆菌。把细胞存储于4℃环境下的Mueller-Hinton琼脂斜面上，并在37℃环境下的Mueller-Hinton肉汤中生长。利用紫外分光光度计（确定培养基的标准为1×107mL-1。

2.1.3.标准

Sigma提供了四环素（TC）、土霉素（OTC）、氯四环素（CTC）、萘啶酸（NALA）、恩诺沙星（ENRO）、麻保沙星（MAR）、诺氟沙星（NOR）、环丙沙星（CIPRO）、氟甲喹（FLU）和单诺沙星（DAN）等标准品。制备了各喹诺酮和四环素在水中的标准贮备液（10mg/L），并把它们存放于-18℃的环境中。用适量的水稀释了各标准贮备液，从而制备了所有药物的标准溶液。

2.2.样品制备

就各个被测验的抗生素而言，都用了纯牛奶样本（X0）作为对照组，分析了三种添加25（X1）、50（X2）和100（X3）μg/L喹诺酮和四环素的牛奶样品。选择了浓度为25μg/L的牛奶，因为这一浓度比牛奶的最高残留限量（即30μg/L的单诺沙星）低。牛奶中喹诺酮和四环素等其它最高残留限量都较高，在50至100μg/L范围之内。

制备样品时，添加了4mL培养基、0.5mL标准化的细菌培养基（1×107mL-1）作为接种物、以及0.5mL纯牛奶；而在制备对照样品时，添加了0.5mL三种不同浓度的添加药物的牛奶。

2.3 传感器分析

2.3.1 总体微生物环境因素

众所周知，用时间函数描绘细菌增长的实验曲线是S形曲线；曲线表示了四个不同的阶段：即迟缓期（潜生长）、对数期（指数生长）、稳定期和衰亡期。

命名为对数期的原因是因为通常用对数型数学模型代表这一阶段。事实上，在这一阶段，微生物（Mi）的数量增加，各繁殖时间（tr）内微生物数量翻倍增长；求得时间t时Mi（n）的数量为：

其中n0表示Mi的起始数量。n与2(t/tr)之间存在指数关系；而logn与t之间存在线性关系。必须添加正确的条件，同时考虑Mi的衰亡率、基质以及微观环境因素。

根据方程（1），假设各微生物以恒定的速度（G，mol/s）通过呼吸生成CO2，那么求得对数期CO2的总体生成速率（CO2，mol/s）为：

2.3.2 抑制剂的作用

可以通过如下等式表示存在抑制剂时微生物的有氧呼吸过程：

其中没有水；Mi表示微生物；M表示培养基；In表示抑制剂；Ca表示降解产物；而O2和CO2表示溶解氧和二氧化碳，取自于气相。分析测量可能会考虑到所有这些成分（即，Mi、M、In、Ca、O2和CO2）。在本研究中，用于间接测定抑制剂抗菌活性的分析物为CO2。

利用培养基中的载气分离了微生物生成的二氧化碳，从而求得了与二氧化碳气体浓度相关的emf（E，mV）：

其中，k°和k表示利用气体标准物质（如已知yco2值的空气样品）通过校正步骤求得的实验值。

图1.CO2传感器设计图

图2.电化学生物传感器系统简图

图3.所记录信号E相对时间的曲线

2.3.3.仪器

利用高性能的非侵入性二氧化碳传感器，结合使用敏感细胞等细菌培养基，研发了一种新的分析系统。该电化学仪器是一种原电池，其中包括浸泡于工作电解液（WS）的参比电极（RE），并通过蚕丝（亲水性物质）与指示电极（IE）相接；这种蚕丝作为传感器薄膜（SM）使用。指示电极是一种金属腐蚀电极，而参比电极是传统型电极或与指示电极类似的腐蚀电极。工作电解液是一种流动性的或静止溶液；其构成成分符合yco2水平要求，并能预防其它气体化学物的阻碍作用。在本研究中，工作电解液就是0.1m水中的KCl、浓度为10-4至10-2m的强碱（如Na2CO3）、以及二氧化碳，直至溶液饱和为止。图1所示为二氧化碳传感器。该传感器的外壳能保护它不受电流和通风的影响。在传感器中钢管与玻璃行业特有的电解池相接。利用个人计算机控制的万用表（产自惠普，型号为Agilent34401A）开展了电位测量。用个人计算机的目的在于获取和加工数据（计算机产自惠普的AgilentIntuiLink）。图2所示为电化学生物传感器系统的简图。

表1

2.3.4.分析程序

让载气以恒定的速率通过含有5mL培养基的参比电池以及二氧化碳传感器流动，直至基线值（E°，MV）保持恒定不变为止。然后，通过样品电池（Xi）连续把载气转移，然后到传感器中。至180分钟时求得了电位差ΔE和时间的值。

五分钟的分析过程如下：

一分钟分析。

四分钟用于分析传感器重新平衡以及通过参比电池（R）的载气。图3所示为所记录的信号。

2.3.5.统计分析

用参数和非参数统计分析获得了各微生物的实验结果。此外，为了评估不同浓度抗菌物与纯牛奶之间差异的显著性，开展了多因子变异数分析。并将Statgraphics软件用于编程。

3.结果与讨论

对气体标准物质（GRMs）的分析测定结果表明，浓度在348至6600ppm这一区间时，传感器的精确度良好（0.8左右），相对标准偏差（σ，%）大约为2.4%。

表1所示为所有样本分析的结果。

总之，研究中的所有喹诺酮和四环素都具有很强的抗菌活性。结果充分证明，在120分钟后抑制程度具有显著意义。在180分钟范围内，抑制程度一直呈现上升趋势。过了这一时间后，ΔE不再发生显著变化。

结语

本研究研发的实验方法和分析方法似乎足以达到本文的目的。例如，与传统的筛查法，细菌抑制法和免疫测定法相比，本文研发的实验与分析方法具有如下优势：（i）分析所费时间非常短（大约120分钟）；（ii）样本量较小（大约为0.5mL）；（iii）不需要处理样本；（iv）精确度高；以及（v）可能会连续地跟踪抑制过程。

此外，把二氧化碳传感器系统与大肠杆菌ATCC11302培养基结合使用，特定用于测验喹诺酮与四环素；但是其它抗菌药物没有产生可测量的分析信号。因此，可以把该方法用于鉴定阳性样品，而且该方法有助于更好的进行之后的化学鉴定。

最后，发现传感器的灵敏度很好，因为它能检测浓度小于等于25μg/L时残留的所有本文研究的喹诺酮类与四环素类物质。从这点来看，当前为牛奶确定的最高残留限量（MRLs）都比25μg/L这一浓度高。

鉴于本研究获得的良好结果，之后会利用不同于大肠杆菌的其它试验微生物研究其它类别的抗菌药物，以扩展这一方法的应用领域。此外，也将考虑其它食品基质。这会是替代传统筛查法的一种有效措施，为此，这是个很好的值得研究的出发点。通常情况下，把这种简单、低成本、快速灵敏的方法用于检测残留的抗菌物，以加强抗菌药物领域的食品管理与监督。

[1]曹亢，曹雪，任发政.牛奶中抗生素残留检测方法的研究进展及展望[J].中国乳业，2009(09).

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