固相萃取–液质联用法同时测定水中的喹诺酮类和磺胺类抗生素*

尹燕敏，沈颖青，顾海东，秦宏兵

（1.苏州市环境监测中心站，江苏苏州 215004； 2.江苏省环境监测中心，南京 210036）

喹 诺 酮 类（quinolones，QNs）和 磺 胺 类（sulifonamides，SAs）药物为广谱抑菌药，因其具有抗菌谱广、高效、低毒、价格低廉等特点，在畜牧、水产等养殖生产中广泛使用［1］。喹诺酮类抗生素大量用于人类和动物医疗，还添加于饲料中以提高饲料利用率和促进动物生长。磺胺类药物用于预防和治疗细菌性感染疾病［2］，但过量使用有可能在人体内蓄积，蓄积浓度超过一定值时对人体有害，并导致病原体产生耐药性［3］。与其它常用抗生素相比，这些药物性质更加稳定，但其在动物源性食品中的残留可通过食物链对人体健康构成危害［1］。

抗生素摄入后大部分以原药和代谢产物的形式随粪尿排出体外，成为新的环境污染物，并以多种途径进入河水、地表水甚至饮用水及土壤中［4］。有调查表明，磺胺药物在人体中长期存在会导致许多细菌对其产生抗药性，且有潜在的致癌性，已被多个国家规定限量或禁止使用；而喹诺酮类药物在美国属水产养殖业的禁用药［5］。

QNs和SAs药物及其代谢物的检测方法主要有高效液相色谱法（HPLC）和高效液相色谱–串联质谱法（HPLC–MS／MS）［6–10］。HPLC的灵敏度较低且无法提供结构信息，一般作为筛选方法；HPLC–MS／MS灵敏度高，选择性和特异性好，抗干扰能力强，能够对目标化合物含量较低的样品进行很好的定性确认，是目前较为先进和常用的动物源性食品中药物残留检测方法。液质联用法由于其较高的灵敏度被广泛应用于环境中抗生素类药物的检测［8–10］。

笔者采用了固相萃取–超高效液相色谱三重四级杆质谱联用法测定了环丙沙星（CIP）、氧氟沙星（OFL）、恩诺沙星（ENR）、洛美沙星（LOM）、诺氟沙星（NOR）5种喹诺酮类和磺胺嘧啶（SDZ）、磺胺-5-甲氧基嘧啶（SM）、磺胺-2-甲基嘧啶（SMZ）、磺胺甲基异噁唑（SMX）、磺胺邻二甲氧嘧啶（SD）、磺胺二甲氧嗪（SDX）6种磺胺类抗生素，优化了前处理条件和分离检测条件，并应用于实际水样的分析，该方法具有操作简单、试剂少、分离速度快、灵敏度高、定量准确、线性范围宽等优点。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

超高效液相色谱三重四级杆质谱联用仪：Waters Acquity UPLC／Xevo TQMS型，美国Waters公司；

全自动固相萃取仪：6位Autotrace SPE，美国Caliper公司；

氮吹仪：MG–2200型，日本EYELA公司；

乙腈、甲醇：色谱纯，美国Merck公司；

甲酸：色谱纯，美国Tedia公司；

氢氧化钠：优级纯，国药集团化学试剂有限公司；

环丙沙星（纯度大于94.0%）、氧氟沙星（纯度大于99.0%）、恩诺沙星（纯度大于99.0%）、洛美沙星（纯度大于97.6%）、诺氟沙星（纯度大于99.0%）标准物质：德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；

磺胺嘧啶、磺胺-5-甲氧基嘧啶、磺胺-2-甲基嘧啶、磺胺甲基异噁唑、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺二甲氧嗪标准物质：纯度大于99%，美国Sigamaldrich公司。

1.2 仪器条件

1.2.1 色谱条件

色谱柱：UPLC BEH C18（50 mm×21 mm，1.7 μm，美国Waters公司）；柱温：40℃；进样量：2 μL；流动相：A为0.01%（体积分数）的甲酸溶液，B为甲醇，梯度洗脱条件见表1，流速为0.4 mL／min。

表1 目标化合物的梯度洗脱程序

1.2.2 质谱条件

采用正离子电喷雾离子源（ESI+），雾化气、脱溶剂气、锥孔气为氮气，碰撞气为氩气；源温度和脱溶剂气温度分别为150℃和500℃；脱溶剂流速和锥孔气流速分别为800 L／h和50 L／h；毛细管电压为3.5 kV；检测方式为MRM模式。

1.3 样品处理

固相萃取：Waters Oasis HLB固相萃取小柱依次用6 mL甲醇活化2次、6 mL水、6 mL甲酸溶液（pH 3）进行活化。水样经0.45 μm 滤膜过滤后取500 mL水样，调pH后过小柱，富集完成后用10 mL水淋洗，氮吹20 min，用12 mL洗脱液进行洗脱，收集洗脱液氮吹至近干后用初始流动相定容至1 mL，过0.2 μm膜进样分析。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件优化

对色谱条件进行优化使分离效果最好和检测时间最短，同时选择有利于离子化的流动相以使质谱的检测灵敏度最高。喹诺酮类药物是两性化合物，磺胺类药物在结构中也含有—NH2，易与色谱填料中的残余硅羟基产生氢键，造成峰形拖尾、展宽，保留时间漂移等现象，成为色谱条件优化的难点。

一般反相色谱的流动相均采用甲醇、乙腈及一定浓度的缓冲盐，而在液质联用法中加入一定浓度的甲酸有利于形成［M+H］+。实验选择甲醇作为流动相，同时考察了在流动相中添加不同浓度的甲酸对色谱分离和质谱灵敏度的影响，发现在不加甲酸的条件下，喹诺酮类很难洗脱，优化甲酸体积分数为0.01%，0.05%，0.1%，0.2%发现随着甲酸含量的增加，目标化合物的响应率有所下降，在甲酸浓度为0.2%时，SM和SMZ无法分离，所以本实验流动相选择为甲醇和0.01%的甲酸水溶液。

2.2 质谱条件优化

采用多反应监测模式（MRM）对目标化合物进行痕量分析。首先，利用Infusion连续进样，在正离子和负离子模式下进行全扫描以选择适当的分子离子峰和电离方式。结果表明，在正离子模式下，这些化合物全扫描的分子离子［M+H］+最理想。因此选用目标化合物的［M+H］+做碰撞诱导解离的母离子。在MS／MS模式下，通过Infusion方式将1 mg／L的目标化合物直接引入三重四级杆质谱进行质谱参数优化，调整碰撞能量找到母离子对应的子离子，并利用Masslynx软件Intellistart功能自动选择子离子和优化锥孔电压、碰撞能量等参数。在确定了待测化合物监测的母离子和子离子的基础上，对各种待测化合物的毛细管电压、锥孔电压、离子源温度、脱溶剂温度等条件进行了优化，结果见表2。

表2 目标化合物的质谱条件

2.3 固相萃取条件优化

影响固相萃取富集效率的因素有固相萃取小柱类型、样品pH、上样速度等，采用空白加标对上述因素进行优化。分别采用C18固相萃取小柱和Waters Oasis HLB小柱对水样进行富集，发现采用HLB小柱时目标化合物的空白加标回收率为86.7%～118%，而采用C18小柱时目标化合物的空白加标回收率为55.3%～84.6%，HLB小柱回收率显著高于C18小柱，所以选用HLB小柱。比较了样品pH值为3和7的空白加标水样的提取效率。发现在pH值为3时，目标化合物的空白加标回收率为84.7%～114%，pH值为7时，目标化合物的空白加标回收率为66.4%～92.3%，因此调节水样pH值为3。

上样流速分别为5，10 mL／min时，空白加标的回收率没有显著差异，选择上样速率为10 mL／min。

2.4 方法线性范围、检出限

将抗生素储备液（100 mg／L）用初始流动相稀释至标准溶液系列（喹诺酮类0.5～50 μg／L，磺胺类1～100 μg／L），按照1.2仪器条件进行分析。以定量离子对的响应面积（Y）和对应浓度（X，μg／L）进行线性回归得到标准曲线。以2～5倍基线噪音响应对应的浓度进行空白加标，以3倍信噪比（S／N）估算方法检出限，11种目标化合物的方法检出限在0.04～0.24 ng／L之间，其线性方程、相关系数r、检出限等见表3。色谱图见图1（喹诺酮类5 μg／L，磺胺类10 μg／L）。

图1 11种目标化合物的总离子流

表3 目标化合物的回归方程、相关系数及方法检出限

2.5 精密度试验

以5 μg／L的QNs和10 μg／L的SAs重复进样6次验证仪器精密度，6次进样的相对标准偏差为QNs 1.7%～6.4%，SAs 2.2%～5.9%。取100 ng／L目标化合物进行空白加标回收试验，6次空白加标的相对标准偏差为QNs 5.3%～9.0%，SAs 4.7%～10.2%。

2.6 实际水样分析与回收试验

在空白水样中分别添加10 ng／L和100 ng／L目标化合物进行空白加标回收试验，采用外标法定量。为了考察不同类型的水体对实验结果的影响，笔者进行了地表水样的加标回收试验，试验结果显示11种目标化合物在实际水样中的加标回收率为62.1%～137%，结果见表4。

表4 实际水样的加标回收结果

3 结论

建立了水中喹诺酮和磺胺类抗生素的超高效液相色谱三重四级杆质谱联用分析方法。该方法可在8 min内完成对11种目标化合物的分析，方法检出限为0.04～0.24 ng／L，外标法定量准确性较好。地表水测定结果表明地表水中已经受到抗生素污染，尤其是磺胺甲基异噁唑的污染，情况应该引起重视。该法具有快速、简便、灵敏、绿色环保的特点，适合环保行业对喹诺酮及磺胺类抗生素的检测。

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