PPARγ基因RNA干扰慢病毒载体构建及干扰Leydig细胞株建立

马明月，张磊，张玉敏，裴秀丛，段志文

(1．沈阳医学院公共卫生学院毒理学教研室，辽宁 沈阳 110034；2．大连市疾病预防控制中心)

过氧化物酶体增殖因子激活受体(peroxisome proliferator activated receptors，PPARγ)是核受体超家族成员，在糖类代谢、脂肪酸氧化以及脂肪细胞分化方面有着重要作用[1]。同时，在细胞分化、发育中有重要作用[2-3]。生殖器官中由特定的配体激活后，PPARγ的调节功能通过调节类固醇合成酶的表达能力。各种内源性因素，如花生酸、脂肪酸和前列腺素代谢产物，可作为PPARγ的天然配体。有些环境内分泌干扰物，如邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHP)及其活性中间产物MEHP作为外源性过氧化物酶体增殖剂，在其致生殖毒性中的作用已引起关注[4-5]。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术是目前最有效的基因功能研究手段之一。慢病毒siRNA表达载体的成功构建使RNAi 技术迈上了新的台阶[6]。研究发现在类固醇合成过程中，睾丸Leydig细胞具有激素分泌功能，且其生成机制均与PPARγ有关[7]，故本研究选择小鼠Leydig细胞株TM3，构建特异靶向小鼠PPARγ基因的RNAi慢病毒载体，建立使用PPARγ基因稳定沉默的Leydig细胞株，旨在为研究PPARγ在生殖毒性研究中的功能提供新的实验模型。

1 材料与方法

1.1 细胞培养 小鼠睾丸间质细胞TM3、慢病毒包装细胞，人胚肾细胞293T细胞(购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心)，常规培养使用含10% FBS (Gibco)的DMEM/F12培养基、DMEM培养基(Gibco)(含1.5 mM L-Glutamine，100 U/ml penicillin，100 μg/ml Streptomycin)中，37 ℃ 5% CO2饱和湿度培养箱中培养。

1.2 针对PPARγ基因的慢病毒载体构建和慢病毒包装 针对Genebank中小鼠PPARγ基因设计的干扰序列，见表1。实验所用慢病毒包装由生工生物工程(上海)公司提供服务。……