浸泡条件下孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿在斑点叉尾组织中分布及消除规律研究

刘永涛艾晓辉索纹纹杨秋红

(1.中国水产科学研究院长江水产研究所, 农业部淡水鱼类种质监督检验测试中心, 武汉430223; 2.中国水产科学研究院淡水渔业研究中心, 无锡 214081; 3.华中农业大学水产学院, 武汉 430070)

刘永涛1,2艾晓辉1,2索纹纹1,3杨秋红1,2

(1.中国水产科学研究院长江水产研究所, 农业部淡水鱼类种质监督检验测试中心, 武汉430223; 2.中国水产科学研究院淡水渔业研究中心, 无锡 214081; 3.华中农业大学水产学院, 武汉 430070)

以7 mg/L的孔雀石绿浸泡斑点叉尾苗种5min后将其饲养于池塘的网箱中, 研究了在养殖模式下孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿在斑点叉尾苗种各组织中的分布及消除规律。采用高效液相色谱串联质谱法(HPLC-MS/MS)分析孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿在斑点叉尾血液、肌肉、皮肤、肝脏、肾脏组织中的浓度水平。采用药代动力学分析软件3p97对血药浓度时间数据进行分析。结果表明, 孔雀石绿和隐色孔雀石绿血药浓度时间曲线符合有吸收二室模型, 动力学方程分别为:C孔雀石绿= 683.063 e−0.248t+ 11.176 e−0.006t− 694.239e−0.333t,C隐色孔雀石绿= 757.240 e−0.222t+ 14.474 e−0.007t– 771.714 e−0.382t。血液中孔雀石绿和隐色孔雀石绿达峰时间Tpeak分别为3.480和3.623h, 峰浓度值Cmax分别为81.560和159.619 ng/mL, 表观分布容积Vd/F分别为37.689和21.125 L/kg, 分布相的一级速率常数α分别为0.248和0.222/h, 消除相的一级速率常数β分别为 0.006和0.007/h, 吸收半衰期T(1/2)α分别为2.794和3.124h, 消除半衰期T(1/2)β分别为113.068和105.841h, 中央室向周边室转运的一级速率常数K12分别为0.020和0.015/h, 周边室向中央室转运的一级速率常数K21分别为0.159和0.121/h, 药-时曲线下面积AUC分别为2493.944和3601.863 ng·h/mL。肌肉、皮肤、肝脏和肾脏组织中孔雀石绿和隐色孔雀石绿浓度水平的结果表明, 孔雀石绿在斑点叉尾4种组织中浓度由高到低的顺序是皮肤>肌肉>肾脏>肝脏, 其中斑点叉尾皮肤组织易蓄积孔雀石绿, 其残留时间最长,肝脏组织由于对孔雀石绿有极强的代谢转化功能而浓度较低。孔雀石绿在肌肉、皮肤、肝脏和肾脏组织中的消除方程分别为C= 5.570 e−0.009t、C= 6.302 e−0.007t、C= 4.791 e−0.006t和C= 4.591 e−0.002t, 相关系数r2≥0.773,消除半衰期T1/2肌肉、皮肤、肝脏和肾脏分别为3.2、4.1、4.8和14.4d。肌肉、皮肤、肝脏和肾脏组织中孔雀石绿分别在45、60、30和60d才未被检测到; 隐色孔雀石绿在斑点叉尾4种组织中浓度由高到低的顺序是肝脏>皮肤>肌肉>肾脏, 残留时间最长的组织也是皮肤组织。隐色孔雀石绿在肌肉、皮肤、肝脏和肾脏组织中的消除方程分别为C= 6.491 e−0.004t、C= 6.958 e−0.003t、C= 6.722 e−0.007t和C= 6.162 e−0.002t, 相关系数r2≥0.673, 消除半衰期T1/2肌肉、皮肤、肝脏和肾脏分别为7.2、9.6、4.1和14.4d。肌肉、皮肤、肝脏和肾脏组织中隐色孔雀石绿分别在90、90、60和90d才未被检出。试验期间(2011年5月17日至7月15日)平均水温为26.4℃, 孔雀石绿和隐色孔雀石绿90d后在各组织中才未检测到, 因此, 使用7 mg/L孔雀石绿浸泡2龄斑点叉尾苗种孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿至少应经过2376℃·d后才能消除。

孔雀石绿; 隐色孔雀石绿; 斑点叉尾; 组织分布; 消除

孔雀石绿是一种N-甲基三苯甲烷类染料, 由于其抗菌效果好, 价格便宜, 容易获得, 曾被广泛用于防治水产动物的真菌病、细菌病和寄生虫病等[1]。孔雀石绿多用于水产动物的繁殖、消毒和运输等环节。由于孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿对人体存在潜在致畸、致癌和致突变的“三致”作用[2—5]。许多国家都将孔雀石绿列为水产养殖禁用药物, 我国也于2002年5月将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》中, 禁止用于所有食品动物中。欧盟从来没有允许孔雀石绿作为兽药, 美国食品和药品管理局也没有批准使用这种染料[6,7]。从目前国内对于鲜活水产品的监测情况来看孔雀石绿仍有检出, 孔雀石绿之所以屡禁不止, 除孔雀石绿抗菌效果好, 价格便宜外, 没有效果相当的替代药物出现也是一个重要的原因。目前, 孔雀石绿在水产动物体内代谢的报道多是关于其在水产动物肌肉组织中残留消除规律的报道[8—14], 涉及的水产动物主要有鳗鲡、罗非鱼、鲫鱼、中华绒螯蟹等, 国内尚未见关于孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿在斑点叉尾体内药代动力学、组织分布与消除规律的报道, 国外Plakas, et al.[12]采用静注和浸泡方式给予斑点叉尾(0.5—0.7 kg)14C标记的孔雀石绿0.8 mg/L研究其代谢规律。由于用药浓度、用药时间、鱼体规格及养殖方式的不同孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿在鱼体内代谢规律会有较大差异。本实验根据我国斑点叉尾养殖过程中实际用药浓度的高限和用药时间研究了养殖模式下孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿在斑点叉尾苗种体内的药代动力学、组织分布与消除规律。为孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿在斑点叉尾苗种中的代谢规律提供了理论数据, 并为加强该药物的管理和监督非法使用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物

1.2 仪器与色谱条件

高效液相色谱-串联质谱(SURYEYOR MS PUMP PLUS, SURYEYOR AUTOSAMPLER PLUS, Thermo TSQ QUANTUM ACCESS MAX)及Thermo LCquan 2.6数据采集处理软件; 自动高速冷冻离心机(日本HITACHI 20PR-520型); Mettler-TOLEDO AE-240型精密电子天平(梅特勒—托利多公司); FS-1高速匀浆机(华普达教学仪器有限公司); 调速混匀器(上海康华生化仪器制造厂); 氮吹仪(AOSHENG, 杭州奥盛仪器有限公司); 固相萃取装置(美国, CNW)。

色谱柱: Hypersil Gold C18 (150.0 mm×2.1 mm× 5.0 µm)反相色谱柱; 柱温: 35℃; 流速0.20 mL/min;进样量 10.0 µL。梯度洗脱条件: A相为乙腈, B相为5 mmol/L乙酸铵溶液用乙酸调pH 4.5, 0—3.00min, 75% A; 3.00—3.01min, 75% A—90% A; 3.01—8.00min, 90% A; 8.00—8.01min, 75% A; 8.01—10.00min 75% A。

1.3 质谱分析条件

离子源: 加热大气压电喷雾离子源(HESI); 离子化模式: 正离子模式; 检测方式采用选择反应监测(SRM)模式; 喷雾电压: 3000 V; 源内解离电压 8 V;鞘气压力20 arb; 辅助气压力5 arb; 碰撞气及压力:氩气, 1.5 m Torr; 离子传输毛细管温度: 350℃; Q1 PW 0.7, Q3 PW 0.7。母离子、定性离子对、定量离子对、碰撞能量和管透镜补偿电压(表1)。

1.4 药品及试剂

孔雀石绿标准品(纯度>93.5 %, Dr.Ehrenstorfer GmbH); 隐色孔雀石绿标准品(纯度>92.5 %, Dr.Ehrenstorfer GmbH); 氘代孔雀石绿标准品(纯度>99.0 %, WiTEGA); 氘代隐色孔雀石绿标准品(纯度>99.0 %, WiTEGA); 试剂级孔雀石绿(分析纯, 天津市天力化学试剂有限公司); 乙腈、乙酸(色谱纯,美国J.T.Baker); 质谱用水(美国, CNW); 乙酸铵(分析纯, 美国J.T.Baker), 中性氧化铝柱(美国, CNW)。

1.5 试验设计与采样

药液的配制: 称取0.63 g孔雀石绿试剂, 溶于90 L水中配制成7 mg/L的孔雀石绿溶液中置于125 L塑料箱中。

表1 孔雀石绿、隐色孔雀石绿、氘代孔雀石绿和氘代隐色孔雀石绿质谱条件Tab.1 MS parameters of MG, MG-D5, LMG and LMG-D6

另设一对照组, 定期采集样品进行分析。

1.6 样品预处理

血液、肝脏、肾脏、皮肤样品的处理 参照中华人民共和国国家标准GB/T 19857-2005《水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定》进行测定, 略有改动。将冷冻保存的血液、肝脏、肾脏和皮肤样品室温下自然解冻, 将每个时间点的肾脏样品合并为一个样品取样量约为0.5 g, 取1.0 mL血液, 1.0 g肝脏、皮肤于10 mL塑料离心管中, 加入80 µL, 100 µg/L混合内标溶液, 加入4 mL乙腈, 振荡30s, 8000 r/min离心5min, 转移到10 mL具塞刻度离心管 再加入4 mL乙腈, 振荡30s, 离心后, 合并提取液于10 mL具塞刻度离心管, 用乙腈定溶至10 mL。取5 mL提取液过中性氧化铝柱, 用4 mL 乙腈洗中性氧化铝柱。将其置于45℃氮吹仪上吹至1 mL, 在加入1 mL pH 4.5乙酸铵溶液, 涡旋振荡30s, 超声提取1min, 取1 mL过0.22 µm滤头过滤后, 上HPLC/MS/MS分析。

肌肉样品的处理 按照中华人民共和国国家标准GB/T 19857-2005《水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定》进行测定。

1.7 标准曲线的制备及回收率与精密度测定

标准曲线的制备: 配制含氘代孔雀石绿和氘代隐色孔雀石绿为内标, 孔雀石绿和隐色孔雀石绿浓度为0.25、0.5、1、2、10、20 ng/mL的低浓度标准曲线; 配制含氘代孔雀石绿内标和氘代隐色孔雀石绿内标, 孔雀石绿和隐色孔雀石绿浓度为50、100、200、500、1000 ng/mL的高浓度标准曲线。作HPLC/MS/MS分析, 以测得的孔雀石绿与氘代孔雀石绿和隐色孔雀石绿与氘代隐色孔雀石绿面积的比值X为横坐标和孔雀石绿和隐色孔雀石绿浓度Y为纵坐标, 绘制标准曲线, 求出回归方程和相关系数。用空白组织制成低质量浓度药物的含药组织, 经预处理后测定, 将引起3倍基线噪音的药物的质量浓度定义为最低检测限。

回收率与精密度测定: 回收率= Cr/C0×100%,其中Cr为用空白血液、肌肉肝脏、皮肤、肾脏组织中加入一定量的孔雀石绿和隐色孔雀石绿已知标准溶液, 再按样品预处理方法进样后, 测定孔雀石绿和隐色孔雀石绿的质量浓度; C0为加入一定量的孔雀石绿和隐色孔雀石绿已知标准溶液。在5种空白组织中分别添加4个浓度水平的标准溶液, 使组织中质量浓度分别为1.0、20.0、50.0、500和1000 µg/kg,血液为1.0、10.00、50.0、200和500 µg/L。每个浓度的样品, 日内做5个重复, 一周内重复做5次, 计算日内及日间精密度。

1.8 数据处理

药物动力学模型拟合及参数计算采用中国药理学会数学专业委员会编制的3P97药动软件分析; 标准曲线, 药物经时曲线图, 消除方程计算和回归图,采用Microsoft Excel 2003, 进行计算和绘制。消除方程采用C=C0e-kt, C表示药物浓度, C0为残留消除对数曲线的截距(µg/kg), k 表示消除速率常数[17]。

2 结果

2.1 标准曲线方程与相关系数

在0.25—20.0 ng/mL和50.0—1000.0 ng/mL范围内孔雀石绿和隐色孔雀石绿线性关系良好, 低浓度线性方程分别为Y=0.07759+0.5499X, Y=0.1696+ 1.777X; 高浓度线性方程分别为Y=0.6803+7.108X, Y=1.230+11.652X; 相关指数均大于0.9988。

2.2 方法检测限、回收率与精密度

在本实验条件下, 血液、肌肉、肝脏、肾脏和皮肤组织中孔雀石绿和隐色孔雀石绿方法检测限均为0.5、0.5 µg/kg。各组织中5个质量浓度加标水平的孔雀石绿和隐色孔雀石绿平均回收率为92.27%—110.67%, 测得的日内精密度与日间精密度均小于10%。

2.3 孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿在斑点叉

将测到的孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿的峰面积分别与其氘代同位素内标峰面的比值, 代入标准曲线方程, 可以求出孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿在斑点叉尾血液中的浓度值(表2)。由表2可以看出, 孔雀石绿和隐色孔雀石绿峰浓度分别出现在4和6h, 浓度分别为(118.16±30.95)和(203.20±24.25) µg/L, 0.5h后孔雀石绿的代谢物隐色孔雀石绿浓度高于孔雀石绿的浓度(图1), 在1080h后孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿才检测不到。

表 2 7 mg/L孔雀石绿浸泡后孔雀石绿及其代谢物在斑点叉尾血液中的浓度(ng/mL, n=5)Tab.2 The concentrations of GM and its metabolite LMG in channel catfish blood after 7 mg/L GM bath n=5

表 2 7 mg/L孔雀石绿浸泡后孔雀石绿及其代谢物在斑点叉尾血液中的浓度(ng/mL, n=5)Tab.2 The concentrations of GM and its metabolite LMG in channel catfish blood after 7 mg/L GM bath n=5

时间Time (h)孔雀石绿MG隐色孔雀石绿LMG 0.25 88.10±26.99 18.75±10.89 0.5 46.05±15.59 81.79±14.23 1 39.58±13.65 78.33±28.45 2 88.22±6.34 118.31±49.02 4 118.16±30.95 176.06±51.77 6 88.18±13.60 203.20±24.25 8 61.26±10.16 140.41±24.67 12 18.87±7.44 34.84±20.37 24 15.44±7.89 54.89±15.25 48 10.41±7.39 9.00±6.52 96 5.38±0.84 12.77±10.84 192 4.87±1.40 2.83±3.51 288 2.78±2.78 5.78±3.04 384 2.91±1.72 0.70±0.58 480 5.45±1.23 8.86±7.61 720 1.20±0.99 2.92±1.21 1080 ND ND 1440 ND ND

表3 7 mg/L的孔雀石绿浸泡斑点叉尾孔雀石绿及隐色孔雀石绿在其体内的药代动力学参数Tab.3 Pharmacokinetic parameters for MG and LMG in channel catfish after water bath administration of 7 mg/L

表3 7 mg/L的孔雀石绿浸泡斑点叉尾孔雀石绿及隐色孔雀石绿在其体内的药代动力学参数Tab.3 Pharmacokinetic parameters for MG and LMG in channel catfish after water bath administration of 7 mg/L

注: A, B为药时曲线对数图上曲线在横轴和纵轴上的截距Drug concentration-time curve on logarithmic graph curve on the horizontal axis and vertical axis intercept; α, β分别为分布相、消除相的一级速率常数First-order rate constant for drug distribution and elimination phase; K21由周边室向中央室转运的一级速率常数First-order rate constant for drug distribution from peripheral compartment to central compartment; K10由中央室消除的一级速率常数First-order rate constant for drug elimination from central compartment; K12由中央室向周边室转运的一级速率常数First-order rate constant for drug distribution from central compartment to peripheral compartment; Vd/F 表观分布容积Apparent volume of distribution; AUC药-时曲线下面积Area under concentration-time curve; Lag time 滞后时间; Ka为一级吸收速率常数First-order rate constant for drug absorption; T(1/2)Ka为药物在中央室的吸收半衰期Absorption half-life in central compartment; T(1/2)α、T(1/2)β分别为总的吸收和消除半衰期The overall absorption half-life and Elimination half-life; Tpeak出现最高血药质量浓度的时间The time at highest peak of concentration; Cmax最高血药质量浓度The biggest concentration of the drug in blood; CL(s)为总体清除率The overall clearance rate

参数Parameters单位Unit孔雀石绿MG隐色孔雀石绿LMG A ng/mL 683.063 757.240 α 1/h 0.248 0.222 B ng/mL 11.176 14.474 β 1/h 0.006 0.007 Ka1/h 0.333 0.382 Lag time h 0.017 0.080 Vd/F L/kg 37.689 21.125 T(1/2)αh 2.794 3.124 T(1/2)βh 113.068 105.841 T(1/2)Kah 2.079 1.816 K211/h 0.020 0.015 K101/h 0.074 0.092 K121/h 0.159 0.121 AUC ng·h/mL 2493.944 3601.863 CL(s) (L/h)/kg 0.002 0.003 Tpeakh 3.480 3.623 Cmaxng/mL 81.506 159.619

数据经回归处理得到肌肉组织中药物浓度(C)与时间(t)关系的消除曲线方程、相关系数(r2)及消除半衰期(T1/2), (表6、7)。孔雀石绿在4种组织中的消除半衰期T1/2(d)肾脏>肝脏>皮肤>肌肉; 隐色孔雀石绿在4种组织中的消除半衰期T1/2(d)肾脏>皮肤>肌肉>肝脏。

图1 孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿在斑点叉尾血液中的代谢规律Fig.1 The depletion of MG and LMG in blood of channel catfish

3 讨论

影响孔雀石绿在鱼体内残留的主要因素有用药时间、用药浓度、水产动物种类、水温、pH等。彭景书等[14]采用3种浓度(0.1、0.2、0.15 mg/L) 的孔雀石绿浸泡青石斑鱼5h和连续浸泡3次, 1次/d,15min/次, 结果表明, 在浸泡浓度相同的条件下连续浸泡3次, 15min/次组中孔雀石绿在青石斑鱼肌肉组织中的残留浓度和残留时间均小于浸泡5h组; 当采用不同浓度(和0.15 mg/L)时连续浸泡3次, 1次/d, 15min/次(0.15 mg/L组)孔雀石绿残留浓度和残留时间仍小于浸泡5h组(0.15 mg/L)可以看出浸泡时间对孔雀石绿在鱼体内残留量及残留时间影响较大, 高露娇等[11]采用0.1和0.2 mg/L的孔雀石绿药浴欧洲鳗鲡24h后转移至清水中孔雀石绿在鳗鲡肌肉中的残留时间>120d。曲志娜等[15]采用0.8 mg/L的孔雀石绿浸泡大菱鲆1h后采集大菱鲆的肌肉组织进行分析, 结果表明, 孔雀石绿降至检测限以下需要20.3d, 而其代谢物隐色孔雀石绿消除则要281.9— 356.7d。由以上报道可以看出除不同水产动物以外, 浸泡用药的时间对于孔雀石绿残留的影响较大。本实验按照水产养殖过程中苗种下塘前孔雀石绿作为消毒剂对其进行浸泡消毒的方式给药, 采用实际应用浓度的上限7 mg/L的浓度, 浸泡5min后将斑点叉尾鱼苗养殖在池塘的网箱中。

表4 7 mg/L孔雀石绿浸泡斑点叉尾孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿在各组织中的浓度Tab.4 The concentrations (µg/kg) of MG and LMG residues in various tissues of channel catfish (n=5)

表4 7 mg/L孔雀石绿浸泡斑点叉尾孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿在各组织中的浓度Tab.4 The concentrations (µg/kg) of MG and LMG residues in various tissues of channel catfish (n=5)

时间Time (h) 肌肉Muscle 皮肤Skin 肝脏Liver肌肉Muscle 皮肤Skin 肝脏Liver孔雀石绿MG 隐色孔雀石绿LMG0.25 413.8±119.5 509.3±292.0 154.8±55.4 709.4±209.5 709.0±165.5 5448.4±1721.6 0.5 441.0±52.8 692.1±283.6 242.2±73.5 837.0±64.5 669.9±218.3 5583.8±1545.0 1 487.7±142.5 707.1±362.9 120.9±34.6 805.1±126.7 590.5±189.6 5109.4±1107.0 2 379.6±170.1 1459.9±1161.6 103.0±56.6 672.9±144.9 750.4±189.6 3010.1±1622.9 4 305.6±88.7 2032.3±932.7 139.4±61.0 759.8±58.6 882.4±766.6 2326.2±892.9 6 402.0±116.2 2208.4±1224.0 63.5±26.9 663.7±27.1 839.1±360.5 1117.4±422.4 8 411.7±110.2 1396.5±791.1 110.5±29.8 868.2±199.7 1206.1±217.5 988.3±5.83 12 307.8±174.5 1378.1±798.0 110.9±61.7 481.2±227.8 934.2±181.3 347.7±20.0 24 122.8±37.8 334.8±54.6 85.3±31.0 422.1±54.4 1078.5±502.1 205.0±6.53 48 116.7±99.1 220.8±55.2 93.8±17.8 420.6±42.7 914.6±148.3 105.0±22.3 96 35.5±28.5 73.3±22.5 71.1±59.7 357.8±196.3 1086.9±5.54 69.9±17.4 192 9.35±0.18 13.84±1.80 30.1±14.0 191.1±49.0 864.2±34.3 74.5±18.0 288 7.03±5.35 9.27±3.30 16.7±0.31 185.9±116.3 720.4±27.8 48.8±32.8 384 7.76±2.00 6.82±2.22 11.6±8.36 233.1±108.0 687.4±152.0 24.0±2.30 480 5.35±0.53 7.60±0.89 8.36±2.31 159.4±60.0 454.4±15.7 35.8±12.0 720 0.72±0.24 2.13±0.15 ND 17.5±5.12 97.7±53.5 7.12±3.54 1080 ND 0.60±0.072 ND 8.01±6.01 15.28±8.61 1.762±0.32 1440 ND ND ND 1.04±0.63 4.32±1.97 ND 2160 ND ND ND ND ND ND

表5 7 mg/L孔雀石绿浸泡后孔雀石绿及其代谢物在斑点叉尾肾脏中的浓度(µg/kg)Tab.5 The concentrations (µg/kg) of GM and its metabolite LMG in channel catfish kidney after 7 mg/L GM bath

表5 7 mg/L孔雀石绿浸泡后孔雀石绿及其代谢物在斑点叉尾肾脏中的浓度(µg/kg)Tab.5 The concentrations (µg/kg) of GM and its metabolite LMG in channel catfish kidney after 7 mg/L GM bath

时 间 Time (h) 孔雀石绿 MG 隐色孔雀石绿 LMG 0.25 255.45 84.90 0.5 270.13 101.24 1 117.91 99.31 2 118.25 156.23 4 102.26 174.43 6 65.91 208.36 8 117.79 301.81 12 93.86 331.50 24 60.00 279.53 48 76.89 362.69 96 89.08 338.71 192 41.07 326.33 288 27.73 222.06 384 35.71 324.28 480 29.82 138.42 720 31.30 41.88 1080 7.88 11.43 1440 ND 2.14 2160 ND ND

图2 孔雀石绿及其代谢物在斑点叉尾肾脏中的代谢规律Fig.2 The depletion of MG and LMG in kidney of channel catfish

图3 孔雀石绿在斑点叉尾各组织中的分布与消除规律Fig.3 The distribution and depletion of MG in tissues of channel catfish

表6 7 mg/L孔雀石绿浸泡斑点叉尾孔雀石绿在各组织中消除曲线方程及相关系数Tab.6 The equation of elimination curve and correlation index of MG in channel catfish after water bath of 7 mg/L MG

表6 7 mg/L孔雀石绿浸泡斑点叉尾孔雀石绿在各组织中消除曲线方程及相关系数Tab.6 The equation of elimination curve and correlation index of MG in channel catfish after water bath of 7 mg/L MG

组织Tissue方程Equation相关系数 r2Correlation coefficient消除半衰期T1/2(d)肌肉 MuscleC= 5.570 e-0.009t0.887 3.2皮肤 Skin C= 6.302 e-0.007t0.811 4.1肝脏 Liver C= 4.791 e-0.006t0.916 4.8肾脏 KidneyC= 4.591 e-0.002t0.773 14.4

表7 7 mg/L孔雀石绿浸泡斑点叉尾隐色孔雀石绿在各组织中消除曲线方程及相关系数Tab.7 The equation of elimination curve and correlation index of LMG in channel catfish after water bath of 7 mg/L MG

表7 7 mg/L孔雀石绿浸泡斑点叉尾隐色孔雀石绿在各组织中消除曲线方程及相关系数Tab.7 The equation of elimination curve and correlation index of LMG in channel catfish after water bath of 7 mg/L MG

组织Tissue方程Equation相关系数r2Correlation coefficient消除半衰期T1/2(d)肌肉 MuscleC= 6.491 e-0.004t0.936 7.2皮肤 Skin C= 6.958 e-0.003t0.828 9.6肝脏 Liver C= 6.722 e-0.007t0.673 4.1肾脏 KidneyC= 6.162 e-0.002t0.891 14.4

国内外关于孔雀石绿在水产动物体内药代动力学特征的报道较少, 在本实验条件下孔雀石绿以7 mg/L的浓度浸泡斑点叉尾后, 孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿药时数据经3p97实用药代动力学分析软件分析, 血液中药物浓度与时间关系符合有吸收二室模型, 孔雀石绿和隐色孔雀石绿动力学方程分别为:

图4 隐色孔雀石绿在斑点叉尾各组织中的分布与消除规律Fig.4 The distribution and depletion of LMG in tissues of channel catfish

图5 0.25 ng/mL MG和LMG标准溶液选择离子监测色谱图Fig.5 SRM chromatograms of 0.25 ng/mL MG and LMG mixed standard

图6 45d肾脏中LMG和LMG选择离子监测色谱图Fig.6 SRM chromatograms of MG and LMG in kidney at 45d

孔雀石绿和隐色孔雀石绿的表观分布容积(Vd/F)分别为37.689和21.125 L/kg, 两者均大于1 L/kg说明孔雀石绿及其代谢物主要分布在血液以外的组织这与Plaska, et al.[12]报道的孔雀石绿有较强的血管外分布的能力相符。孔雀石绿通过浸泡方式进入斑点叉尾体内进而进入血液循环, 孔雀石绿的达峰时间为3.480h, 浓度为81.506 ng/mL, 吸收速率为0.333/h, 分布半衰期为2.794h, 消除半衰期较长(113.068h)与药物分布量的曲线下面积(AUC)较大(2493.944 ng·h/mL)两者是相关的。K21

中的分布规律

目前, 关于孔雀石绿及其代谢物在水产动物体内各组织中分布与消除规律的报道较少, 多数仅研究了水产动物肌肉组织中孔雀石绿和隐色孔雀石绿消除规律[8—10,13—15]。本实验研究了孔雀石绿在斑点叉尾皮肤、肝脏、肾脏和肌肉4种组织中的分布与消除过程, 孔雀石绿在斑点叉尾4种组织中浓度由高到低的顺序是皮肤>肌肉>肾脏>肝脏, 其中斑点叉尾皮肤组织易蓄积孔雀石绿, 其残留时间最长, 肝脏组织由于对孔雀石绿有极强的代谢转化功能而浓度较低; 隐色孔雀石绿在斑点叉尾4种组织中浓度由高到低的顺序是肝脏>皮肤>肌肉>肾脏, 残留时间最长的组织也是皮肤组织。从孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿在各组织的消除半衰期来看皮肤组织消除半衰期T1/2较长分别为4.1和9.6d,而孔雀石绿和隐色孔雀石绿在肌肉组织中的消除半衰期T1/23.2和7.2d, 这可能与斑点叉尾皮肤组织中含有较多脂肪, 而孔雀石绿具有亲脂性有关。目前, 我国对于水产品中孔雀石绿和隐色孔雀石绿的监控主要是鱼体的可食组织-肌肉组织, 从实验结果可以看出孔雀石绿和隐色孔雀石绿易在皮肤组织中蓄积, 而且消除时间也相对较长, 建议相关部门将水产动物的可食组织皮肤和肌肉一起列为检测靶组织。试验期间(2011年5月17日至2011年7月15日)平均水温为26.4℃, 因此, 使用7 mg/L孔雀石绿浸泡2龄斑点叉尾苗种孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿至少应经过2376℃·d后才能消除。

图7 45d 肌肉中MG和LMG选择离子监测色谱图Fig.7 SRM chromatograms of MG and LMG in muscle at 45d

图8 45d皮肤中LMG和LMG选择离子监测色谱图Fig.8 SRM chromatograms of MG and LMG in skin at 45d

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TISSUE DISTRIBUTION AND ELIMINATION OF MALACHITE GREEN AND ITS METABOLITE LEUCOMALACHITE GREEN FROM CHANNEL CATFISH (IETALURUS PUNETAUS) AFTER BATH TREATMENT

LIU Yong-Tao1,2, AI Xiao-Hui1,2, SUO Wen-Wen1,3and YANG Qiu-Hong1,2
(1.Yangtze River Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Science, Freshwater Fish Germplasm Quality Supervision and Testing Center, Ministry of Agriculture, Wuhan 430223, China; 2.Freshwater Fisheries Research Center, Chinese Academy of Fishery Science, Wuxi 214081, China; 3.College of Fisheries, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)

The distribution and depletion rules of MG and its metabolite LMG in channel catfish was investigated after bath treatment of 7 mg/L MG.Channel catfish were raised in the cages in the pool.Blood, muscle, liver, skin and kidney of channel catfish were analyzed by HPLC/MS/MS.The data of drug concentration-time were analyzed using pharmacokinetics software 3p97.The results showed that blood concentration-time data of MG and LMG were both best fitted using a two-compartment model with first absorption.The pharmacokinetic equations were CMG=683.063 e−0.248t+11.176 e−0.006t− 694.239 e−0.333tand CLMG=757.240 e−0.222t+14.474 e−0.007t– 771.714 e−0.382t.Peak concentrations of MG and LMG were 81.560 ng/mL and 159.619 ng/mL at 3.480h and 3.623h, respectively.The distribution volume (Vd/F) of MG and LMG were 37.689 L/kg and 21.125 L/kg, respectively.First-order rate constants for MG and LMG distribution phases (α) were 0.248/h and 0.222/h, respectively, First-order rate constants for MG and LMG elimination phases (β) were 0.006/h and 0.007/h respectively.The absorption half-lifeT(1/2)αwere 2.794h and 3.124h, respectively.The elimination half-lifeT(1/2)βwere 113.068h and 105.841h respectively.First-order rate constants for MG and LMG distributions from central compartment to peripheral compartment (K12) were 0.020/h and 0.015/h respectively.First-order rate constants for MG and LMG distributions from peripheral compartment to central compartment (K21) were 0.159/h and 0.121/h, respectively.The areas under the curve (AUC) were 2493.944 ng·h/mL and 3601.863 ng·h/mL.The results of MG and LMG concentrations in muscle, skin, liver and kidney of channel catfish showed that the orders of 4 kinds of tissues concentration levels of MG from high to low were skin, muscle, kidney and liver.MG was easy to accumulate in skin, and residue time was the longest.Because MG was metabolited by liver fastly, low concentrations of MG were determined in liver.The Elimination equations of MG in muscle, skin, liver and kidney were C= 5.570 e−0.009t, C= 6.302 e−0.007t, C= 4.791 e−0.006tand C= 4.591 e−0.002t.Those correlation coefficients (r2) were ≥0.773 respectively.The elimination half-life (T1/2) of MG in muscle, skin, liver and kidney were 3.2d, 4.1d, 4.8d and 14.4d, respectively.MG was not detected in muscle, skin, liver and kidney of channel catfish at 45d, 60d, 30d and 60d respectively.The orders of 4 kinds of tissues concentration levels of LMG from high to low were liver, skin, muscle kidney.The tissue with the longest residue time of LMG was also skin.The Elimination equations of LMG in muscle, skin, liver and kidney were C= 6.491 e−0.004t,C= 6.958 e−0.003t,C= 6.722 e−0.007t, andC= 6.162 e−0.002t, repectively.The correlation coefficients (r2) of them were ≥0.673.The elimination half-life of MG in muscle, skin, liver and kidney were 7.2d, 9.6d, 4.1d and 14.4d.LMG was not detected in muscle, skin, liver and kidney of channel catfish at 90d, 90d, 60d and 90d, respectively.MG and LMG were not detected at 90d and the average water temperature was 26.4℃ during the experiment from May 17, 2011 to July 15, 2011.Malachite green and its metabolite Leucomalachite green should at least through 2376℃·d to eliminate at 7 mg/L malachite green for 2 age of channel catfish.

Malachite green; Leucomalachite green; Channel catfish (Ietalurus punetaus); Tissue distribution; Elimination

S948

A

1000-3207(2013)02-0269-12

10.7541/2013.14

2012-02-13;

2012-11-20

中国水产科学研究院基本科研业务费项目“3种禁药在主要水产养殖动物体内的残留评估”(2011C008); 2011年农业部财政项目“水产品质量安全监测”; 中央及公益性研究院所基本科研业务费专项资金项目(2011JBFA19)资助

刘永涛(1979—), 男, 山东潍坊人; 在读博士, 助理研究员; 主要从事水产药理及检测技术研究。E-mail: thincat2005@ sina.com

艾晓辉, 博士, 研究员; E-mail: aixh@yfi.ac.cn