杜仲叶醋发酵工艺参数优化

贾春凤 刘 恺 陈梅香

JIA Chun-feng LIU KaiCHEN Mei-xiang

（保定学院，河北 保定 071000）

(Baoding College,Daoding,Hebei071051,China)

当今，大量资料[1-5]显示：醋已从单纯的调味品逐渐成为药疗与食疗俱佳的著名食品之一。目前保健醋的种类繁多。有枣醋[1]、苹果果醋[2]、柿子醋饮[3]、岐山香醋[4]、杨梅果醋[5]、木瓜果醋[6]、胡柚果醋[7]等等。这些醋产品都是根据不同的原料来命名的，并根据其特性进行了工艺研究。特定的工艺针对特定的原料有利于保持原物料的特性及营养价值，从而更好地达到保健目的。

杜仲(eucommia ulmoides oliver)为杜仲科(eucommiace-ae)植物，是具有悠久使用历史的名贵药材，一般以皮入药。研究发现，杜仲叶中含有的化学成分和杜仲皮中的极为相似、且二者具有相近药理作用[8,9]，杜仲叶绿原酸含量为1.27%～4.06%[10]，杜仲叶中绿原酸含量相当丰富，因此，《中华人民共和国药典》2005年将绿原酸定为评价杜仲叶质量优劣的主要技术指标[11]。中国杜仲资源丰富，但杜仲叶利用率较低，仅10%～20%[12]。

本试验主要对以杜仲叶为主要原料的杜仲叶醋发酵工艺进行研究，可以充分利用中国杜仲叶资源。本试验除了以传统的糖、乙酸含量为发酵工艺测定目标外，还增添了绿原酸含量的检测，更突出了杜仲叶醋的保健功能，同时为杜仲叶醋工业化生产提供技术参数。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

杜仲叶：陕西省汉中市略阳县秋季老叶；

醋前发酵剂：上海佳民酿造食品有限公司；

纤维素酶：1×104U/g，北京奥博星公司；

95%的乙醇、乙腈、冰乙酸、氢氧化钠：分析纯，北京奥博星生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

电子天平：AB104-N型，上海第二天平仪器厂；

高效液相色谱仪，LC-20AT型，日本岛津公司；

手持式糖量折光仪：WAY-32型，上海光学五厂；

分析天平：PL403型，梅特勒—托力多仪器(上海)有限公司；

恒温水浴锅：DSY-2-8型，北京国华医疗器械厂；

往复式水浴恒温振荡器：SHZ-88型，江苏太仓市试验设备厂。

1.3 方法

1.3.1 杜仲叶醋发酵工艺流程

1.3.2 单因素试验设计 分别对不同的麸皮添加量、料液比、灭菌时间进行单因素试验，以糖含量为指标，选择正交试验的因素水平。

1.3.3 正交试验优化 根据单因素试验结果，采用 L9(33)正交试验设计，以糖含量和绿原酸含量为指标优化乙醇发酵前工艺条件。

1.3.4 乙醇发酵时间、乙酸发酵时间、葡萄糖添加量对杜仲叶醋发酵的影响 在1.3.3最优试验条件下，测定乙醇发酵最佳时间、乙酸发酵最佳时间，发现发酵结果—乙酸含量低于国家标准，添加不同含量的葡萄糖，考察葡萄糖添加量对发酵结果—乙酸和绿原酸含量的影响。

1.3.5 杜仲叶醋品质评价 参照GB 18187——2000，对成品的感官指标、理化指标和卫生指标进行分析。

1.3.6 乙酸菌AS.14l悬液制备 参照文献[13]。

1.3.7 绿原酸和乙酸测定方法

(1)绿原酸含量测定：高效液相色谱法测。迪马C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm），以乙腈∶水∶冰乙酸(12∶88∶1)为流动相，检测波长325 nm，柱温30℃，流速1.0 mL/min，进样量5μL。将稀释后的样品测得峰面积代入已测方程：y=16 362x-137 670，R2=0.996 7，求得含量绿原酸。

(2)乙酸含量的测定：酸碱中和滴定法。具体操作：吸取0.1mL试样置于试管中，加入3.9mL蒸馏水，充分震荡混匀，用氢氧化钠溶液（c(NaOH)=0.0050 mol/L或c(NaOH)=0.050mol/L）滴定至酚酞变色为滴定终点，记录消耗氢氧化钠标准滴定溶液的毫升数，可计算总酸含量。

1.4 数据处理

每组试验重复3次，试验数据用SPSS 17.0进行了处理和分析，最后取用平均值表示。用Sigmaplot 10.0作图，试验最终结果用平均值±标准误差表示。

2 结果与分析

2.1 酶解液中绿原酸含量的测定

根据方法1.3.1，测定本次酶解液中绿原酸的含量为(1.26±0.11)mg/mL。

2.2 乙醇发酵前工艺参数的选择试验结果

2.2.1 麸皮添加量的影响 在10 mL杜仲叶酶解液中加入不同质量分数的麸皮：0.5，1.0，1.5，2.0 g。121 ℃灭菌 30 min后冷却，不加糖，未进行发酵，直接测定糖含量。由图1可知，随着麸皮添加量的增大，糖的含量呈现上升趋势，在添加2.0 g麸皮时，经灭菌后样品中液体存在量很少，添加量为0～1.0 g/10mL时，糖含量增加较快，添加量为1.5～2.0 g/10mL时，糖含量增加较慢，因此确定1.5 g/10mL麸皮添加量为本试验最佳试验参数。

图1 麸皮添加量对糖含量的影响Figure1 Effectofbran addition on the contentofsugar

2.2.2 水添加量的影响 10 mL酶解液中添加1 g麸皮，0，5，10，20mL 蒸馏水，121 ℃灭菌 30min后冷却，不加糖，未进行发酵，直接测定糖含量。由图2可知，水的添加量对糖含量的影响相当大。随着水添加量的增加，糖含量呈显著下降趋势，因此水的添加量为0mL时，只添加10mL杜仲酶解液时，糖含量最高。

图2 水的添加量对糖含量的影响Figure2 Effectofwateraddition on the contentofsugar

2.2.3 灭菌时间的影响 10mL酶解液中添加1.5 g麸皮，在121 ℃下灭菌时间分别设为 15，20，30，40min，放凉，不加糖，未进行发酵，直接测定糖含量。由图3可知，糖含量随着加热时间的延长少有增加，尤其是加热40min比加热30min的样品中糖的含量只增加了0.2%。因此，取20，30，40min作为下一步试验研究对象。

2.2.4 正交试验结果与分析 根据单因素试验设计的正交试验因素及水平见表1，试验设计及结果见表2。

由表2可知，料液比对糖含量影响最大，接着是麸皮的添加量，最后是灭菌时间。由于当麸皮添加量为2 g时，样品中的液体含量已经很少，因此在本试验中以糖含量为测定目标的正交试验结果显示乙醇发酵前最佳工艺：麸皮添加量为2 g，只添加10mL杜仲叶酶解液，灭菌时间为40min。结合单因素数据进一步分析可知灭菌30min时，糖的含量只比40min时少0.2%，本着在对糖含量影响不大，节约能源的原则，最佳灭菌时间定为30min。此时，绿原酸含量为 (0.6±0.022)mg/mL：

图3 灭菌时间对糖含量的影响Figure3 Effectofhated time on the contentofsugar

表1 正交试验因素及水平Table1 Factorsand levelsoforthogonal tests

在此最优工艺参数下，根据1.3.1工艺进行发酵，乙醇发酵在第4天，糖含量基本不变；乙酸发酵到第5天，乙酸含量开始下降，但第4天最高含量的乙酸小于1 g/100 mL，因此乙醇发酵前需要补糖。

2.3 乙醇发酵时间和乙酸发酵时间的确定及葡萄糖的添加量对乙酸发酵的影响

由表3可知，乙醇发酵到第3天时，各样品中糖含量几乎降到最低，因此乙醇发酵最佳时间为3 d。不添加葡萄糖时，样品发酵到在第4天时乙酸含量达到最高，第5天开始下降；添加了2%和4%葡萄糖的发酵样在乙酸发酵的第3天和第4天分别出现最高乙酸含量，虽然还是较低，但已达到GB 18187——2000中规定值（总酸≥3.5 g/100mL，以乙酸计）；和其他样品比较，添加6%葡萄糖样品在第4天时乙酸含量最高，并远远高于GB 18187——2000中规定值；并且，乙酸发酵到第4天时，各样品中绿原酸含量变化幅度较小；因此乙酸最佳发酵时间为4 d，葡萄糖最佳添加量为6 g/100mL。

表2 正交试验设计及结果Table2 Orthogonalarray design and results

表3 糖的添加量对杜仲叶醋乙酸的影响Table3 Effectofglucoseaddition on eucommiaulmoidesvinegar

由试验结果可知，糖添加量能够促使乙醇生成，有利于乙酸发酵；但随着葡萄糖添加量的增加，其乙酸含量最高值出现时间逐渐延长，可能是高糖产生的高乙醇含量抑制了乙酸菌代谢形成乙酸，使之代谢减缓造成的[14]。绿原酸的含量却随着糖的添加量的增加而略有增加，这可能是绿原酸易溶于乙醇和乙酸的性质造成的，但整体变化不大。发酵到第4天时，添加6%葡萄糖样品绿原酸的含量为0.61mg/mL。研究[15]表明，当绿原酸溶液绿中原酸含量为大于等于0.1mg/mL时对过氧化氢的最大清除率可达95.43%；对氧自由基和羟自由基清除效果较好较稳定，对脂质过氧化也有明显的抑制作用。因此本最优工艺下的杜仲叶醋有较好的抗氧化功能。

2.4 产品质量指标

2.4.1 感官指标 色泽：红棕色，透亮；香气：醋香味和杜仲叶特有的药香味；滋味：醋味鲜，略有淡淡的杜仲叶药味；体态：纯净，无悬浮物，无杂质。符合GB 18187——2000规定。

2.4.2 理化指标 总酸(以乙酸计)为(4.46±0.05)g/100mL，绿原酸含量为(0.60±0.06)mg/mL，游离矿酸、总砷、铅、黄曲霉毒素符合GB 18187——2000规定。

2.4.3 卫生指标 菌落总数≤100 CFU/mL，大肠菌群未检出，致病菌未检出，符合GB 18187——2000规定。

3 结论

本试验以资源丰富的杜仲叶为主要原料，进行酶解；采用L9(33)正交试验设计，分别考察了水添加量、麸皮添加量及灭菌时间对糖和绿原酸的影响；并考察乙醇发酵时间、乙酸发酵时间和葡萄糖添加量对乙酸和绿原酸含量的影响，确定最佳工艺为原料配比是麸皮质量∶葡萄糖质量∶杜仲叶酶解液体积为2∶0.6∶10，121℃灭菌30min；乙醇发酵最适时间为3 d；乙酸发酵最适时间为4 d，最终可得总酸(以乙酸计)为(4.46±0.05)g/100 mL、绿原酸含量为(0.60±0.06)mg/mL 的优质杜仲叶发酵醋。

1 郑战伟,王静,陈菁,等.枣醋乙酸发酵工艺优化[J].中国调味品,2011,47(3):47～50.

2 许凯扬,熊诗璇,陈璇,等.苹果果醋加工过程的发酵工艺研究[J].食品与机械,2011,27（3）:130～132.

3 白卫东,刘晓艳,赵文红,等.柿子醋饮料的加工工艺研究[J].食品与机械,2007,23(5):125～133.

4 陈红军.岐山香醋乙酸发酵过程控制[J].中国调味品,2010,36(4):83～84.

5 谢思云,钟瑞敏,肖仔君,等.杨梅果醋体外抗氧化活性的研究[J].食品与机械,2012,28(6):125～128.

6 安玉红,任廷远,阚建全.木瓜果醋发酵工艺的研究[J].中国酿造,2010(3):171～175.

7 杨颖,邢建荣,陆胜民,等.胡柚果醋的发酵工艺研究[J].浙江农业学报,2011,23(3):588～592.

8 刘迪.杜仲叶叶抗疲劳功效分子机制与抗氧化作用关联性研究[D].太原:陕西科技大学,2011.

9 周琳娜,张红霞,张艳艳,等.纤维素酶辅助水解杜仲叶叶醋的发酵条件[J].食品工业科技,2012,33(12):201～204.

10 张万峰.不同月份杜仲叶叶中绿原酸含量的研究[J].安徽农业科学,2008,36(19):8 145～8 146.

11 国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].北京:化学工业出版,2004.

12 刘俊海,任惠兰,裘爱泳.杜仲叶中总黄酮提取工艺研究[J].食品与机械,2007,23(4):92～118.

13 周琳娜.杜仲叶叶的发酵及其a-葡萄糖苷酶抑制活性[D].北京：北京林业大学,2012.

14 刘晓栋,佘跃惠,张鸿翼.乙酸菌培养条件研究[J].化学工程师,2007(1):17～19.

15 胡宗福,于文利,赵亚平.绿原酸清除活性氧和抗脂质过氧化的研究[J].食品科学,2006,27(2):128～130.