生物法制备低过敏乳的研究进展

叶笑艳 钱 方 孙 洋 牟光庆 姜淑娟

YE Xiao-yan1 QIAN Fang1 SUN Yang2 HMU Guang-qing1 JIANG Shu-juan1

（1.大连工业大学食品学院，辽宁 大连 116034；2.大连工业大学信息科学与工程学院，辽宁 大连 116034）

(1.School of Food Science and Technology,Dalian Polytechnic University,Dalian,Liaoning 116034,China;2.School of Information Science and Engineering,Dalian Polytechnic University,Dalian,Liaoning 116034,China)

牛乳是人类最主要的乳资源，营养丰富，几乎含有人体所有的必需氨基酸。在发达国家乳蛋白及其制品提供了20%～30%的食物蛋白，显示了乳蛋白广泛的应用前景。然而，牛乳亦给过敏体质的特殊人群带来麻烦[1]。0.5%～7.5%的儿童和约1%的成年人发生牛乳过敏现象，严重影响人体健康，在全球范围内引起广泛关注[2]。制备低过敏乳不仅可以扩大牛乳的食用人群，而且为乳制品的多样化生产提供原料。一般来说，引起食物过敏的过敏原大都来源于食物蛋白，而实际上与过敏反应相关的仅为其部分抗原决定基（数个至数十个氨基酸），即“表位”（epitope）。乳蛋白过敏表位分为连续性过敏表位（线性表位）和不连续性过敏原表位（构象表位）。线性表位是由某些氨基酸残基按一定顺序连续排列组成的线状序列，属于蛋白分子的一级结构；构象表位是由分子内不连续的氨基酸残基组成，属于蛋白分子的二级或三级结构[3,4]。线性表位的活性依赖于氨基酸序列的一级结构，构象表位的活性依赖于构象。因此如何破坏或去除过敏表位就成为开发低过敏食品的关键所在[5]。

1 牛乳主要过敏蛋白组成

美国乳品科学协会委员会基于牛乳蛋白的氨基酸序列，将其分为酪蛋白和乳清蛋白。酪蛋白（casein)主要含α-酪蛋白、γ-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白；乳清蛋白（whey protein)主要含 α-乳白蛋白（α-LA)、β-乳球蛋白（β-LG)、血清白蛋白（BSA)、免疫球蛋白（LGS)等[6]。绝大多数的牛乳蛋白都潜在过敏性，目前普遍认为casein、β-LG及α-LA是主要过敏原，BSA、LGS是次要过敏原。牛乳中β-LG占乳清蛋白50%，而人乳中不含β-LG[7]。因此该蛋白被认为是牛乳中最主要的过敏原之一[8]。

β-LG分子量为18 kDa左右，等电点为5.3，由162个氨基酸残基组成[9]。其中包括5个半胱氨酸（Cys)残基和2个酪氨酸（Try)残基（Trp19和Trp61)[10]，半胱氨酸中的4个残基形成了二硫键（Cys106-Cys119、Cys66-Cys160)，而另1个巯基在蛋白质的121位置上。牛乳中β-LG以非共价键连接成二聚体，并通过氢键达到稳定结构[11]。

β-LG属于强过敏原脂质转运蛋白（lipocalin)家族。lipocalin蛋白结构上的重要特征就是在其N-端有不易被破坏的相似序列，19位总是色氨酸。且具有相同由重复排列的8或 10个反向平行的 β-片层组成（A、B、C、D、E、F、G、H、I)及β-桶状结构（A和H之间闭合结构)（图1)[12]。其中，β-LG的41～60、102～124、149～162 表位可被 90%～100%牛乳过敏患者血清识别，被称为主要过敏表位。另有 1～8、25～40、92～100 表位，可被58%～72%过敏患者血清识别[13,14]。有研究[15]报道，β-LG耐胃酸、耐胃蛋白酶水解，即使通过胃肠道仍保持完整的β-LG或致敏肽段，仍具有致敏性。

图1 牛乳中β-LG的三维结构Figure 1 Three-dimensional structure ofβ-LG inmilk

2 降低牛乳蛋白过敏性的方法

牛乳蛋白过敏性的降低主要是用物理法（热、射线、机械震荡等）、化学法（化学试剂）、生物法（酶法水解、发酵）等破坏蛋白质的过敏表位[16]。

物理法中热处理是食品加工最常用的一种方式。热处理可使蛋白质分子之间发生共价或非共价的相互作用，导致蛋白质空间构象或三级结构发生变化，所产生的聚合物在一定程度上可掩盖其过敏表位，从而降低其过敏性[17]。热处理方式很多，如烘烤、蒸煮、煎炸等，对蛋白的过敏性产生不同影响。

化学法中糖基化在降低牛乳蛋白过敏性中得到广泛应用[18]，是通过蛋白质和糖类之间的美拉德反应，使乳蛋白生成结构复杂的糖基化合物，乳蛋白中过敏线性表位和构象表位结构被破坏，从而降低蛋白过敏性。最常用也是研究最多的是聚乙烯乙二醇及其衍生物(PEGs）和羧甲基葡聚糖(CMD）[19]。

目前，生物法制备低过敏乳常用酶法水解和乳酸菌发酵两种方法[20]。酶法水解反应条件温和，不会导致营养损失，也不会产生毒理方面问题。此外，还具有时间短、酶解程度可控制，在低酶浓度下即产生显著效果等优点[21]。乳酸菌发酵不仅可以改善牛乳风味，在菌体生长过程中可产生新的功能水解物，是降低牛乳过敏的有效技术[22]。

3 生物法制备低过敏乳

3.1 酶法水解制备低过敏乳

酶法水解是利用一种或多种蛋白酶对蛋白质进行限制性水解，产生小分子肽和氨基酸。按照酶解程度不同，可分为轻度酶解、适度酶解和深度酶解。轻度酶解和适度酶解被认为是限制性酶解，可实现水解度和酶解产物多样化的调控，主要用于生产功能性蛋白或生理活性肽；深度酶解产物主要是小肽和氨基酸，主要用于调味品和营养配方[23]。不同程度酶法水解产物的过敏性得到不同程度的降低，近年来轻度酶解在开发低过敏食品领域得到广泛应用。

传统的食品加工方法（如物理法）对乳蛋白构象表位破坏程度较大，而酶法水解对其线性表位破坏程度较大。酶法水解对过敏乳蛋白的作用主要有两方面：①肽键断裂，过敏线性表位减少，从而降低过敏性；②改变抗原决定簇的三级结构，即过敏构象表位减少，使过敏蛋白失去活性，降低过敏性[24]。不同程度酶法水解的婴幼儿配方乳粉已上市，虽降低了乳的过敏性，但并未完全消除，对极少数人群仍存在过敏性。酶解过程中酶的种类、酶解方式、酶解程度等因素对乳蛋白过敏性的降低起着重要作用。

酶的选择是酶法水解的关键，由于乳蛋白过敏原表位的广泛存在，选酶具一定盲目性。酶解牛乳过敏蛋白的常用酶有：胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、凝乳蛋白酶、胃蛋白酶和酸性蛋白酶等[25]。比如，β-LG主要过敏线性表位 41～60、102～124、149～162 的氨基酸序列与胰蛋白酶（酶切位点：Arg、Lys的 C 端）、木瓜蛋白酶 (酶切位点：Gly、Val、Leu、Arg、Lys、Phe等的 C 端)和中性蛋白酶（酶切位点：Leu、Ile、Phe的C端）的酶切位点吻合。因此，这3种酶均可水解破坏β-乳球蛋白的主要过敏表位，得到低过敏产物。

酶解前通过热处理使蛋白质变性是非常重要的，热处理后牛乳蛋白构象发生改变，结构展开，对蛋白酶更加敏感[26]。Kim等[27]用胃蛋白酶和胰蛋白酶双酶体系50℃下分别水解天然的和热处理（100℃，10min）的2%浓缩乳清蛋白。结果发现，随着酶量的增加，两者的抗原性均降低。与天然浓缩乳清蛋白相比，热处理的浓缩乳清蛋白抗原性更低。Lametti等[28]用胰蛋白酶或胰凝乳酶分别在55，60，65℃，中性条件下水解牛乳β-LG，从蛋白的结构变化上阐明，蛋白酶解使多数引起抗原性因子的过敏表位减少甚至消失，最终导致水解产物的低过敏性。

张洁等[29]用胰蛋白酶水解乳蛋白发现，当水解度为4%～10%时，乳蛋白水解物的抗原性明显降低且变化程度较小。因此，从经济角度考虑以水解度达到4%为指标，优化胰蛋白酶水解条件，得到的轻度酶解产物作为婴儿配方食品的原料，可降低婴儿过敏反应的发生。Martinez等[30]用胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶水解牛乳蛋白，将乳清蛋白和酪蛋白按照人乳比例配比，控制蛋白浓度为 4%～6%，在 pH≥6.6，30～50 ℃，2～6 h下控制水解度在4%～10%。结果发现，随着酶解进行，乳蛋白过敏表位被破坏并生成小分子肽，其抗原性降低约90%。

3.2 发酵法制备低过敏乳

牛乳经过发酵后，其过敏性会大大降低甚至消失。一种可能性是发酵乳的有效成分进入机体后，调节辅助性T细胞（helper T cell,Th）中Th1和Th2免疫反应之间的平衡，从而防止过敏发生。Matsuzaki等[31]研究发现，牛乳过敏可能是由于Th1与Th2免疫反应的不平衡所引起的。口服干酪乳杆菌发酵乳可抑制机体产生免疫球蛋白（IgE），刺激机体产生自然杀伤细胞（NK细胞），从而调节机体Th1和Th2免疫反应的平衡，达到防止过敏的目的。

牛乳发酵降低过敏性的另一种可能机制是乳酸菌发酵产生蛋白酶，进而水解乳蛋白过敏表位[32]。针对这种机制的相关研究较多。

乳酸菌水解蛋白质的能力差异很大，主要与菌体内蛋白酶活性有关。存在于细胞表面的蛋白酶把蛋白质切断至肽，然后渗入细胞内，被细胞内蛋白酶分解成氨基酸。一般来说乳杆菌的酶活性比球菌高。研究[33]发现，乳酸杆菌中呈现一种广泛的肽酶活性，不仅包括肽链外切酶还有肽链内切酶。由此可知，乳酸菌发酵产生的蛋白酶和肽酶进行乳蛋白水解，破坏乳蛋白的过敏位点可在一定程度上降低牛乳的抗原性。

Kleber等[34]筛选乳酸菌以降低脱脂牛乳和甜乳清的抗原反应，通过ELISA反应量化β-LG的抗原活性，结果发现：乳酸菌发酵法能有效地降低牛乳抗原活性。筛选菌株使两种原料中β-LG抗原性分别降低70%和90%，这不仅是因为牛乳的成分不同，更重要的是不同乳酸菌释放的蛋白酶种类和活性各有差异。

Haddad等[35]发现牛乳经90～95℃热处理10～15 min后，β-LG与酪蛋白微粒结合，再经嗜温和嗜热乳酸菌或混合菌种37℃发酵，酸乳抗原性比鲜乳降低了99%以上。故热处理和乳酸菌发酵相结合，降低牛乳蛋白抗原性的能力更强。

4 结论

牛乳是人类不可或缺的食品，其营养价值一直被大家所重视，同时，牛乳及乳制品又是主要过敏食品之一[36]。与传统的物理法和化学法降低牛乳过敏性相比，生物法在降低其过敏性的同时，还可改变牛乳本身的风味。乳酸菌分解乳糖产生乳酸，及丙酮酸代谢过程中产生挥发性物质（乙酸、乙醇、丁二酮和乙醛）等赋予食品典型的香味，应用前景更广[37]。经生物法处理的牛乳，其抗原性有很大程度下降，但却不能完全消除，这仍旧限制着乳制品的食用人群。因此，研究工作者仍致力于牛乳过敏的应用基础研究，为生产出安全、无过敏的乳制品提供理论和技术支持。

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