桃果实PpCuZnSOD基因的原核表达、纯化与鉴定

吴军帅 丛丽君等

摘 要： 【目的】为了实现桃铜锌超氧化物歧化酶在大肠杆菌中的高效表达，获得表达稳定、蛋白纯度高、活性强的工程菌，【方法】将前期获得的PpCuZnSOD基因（GenBank登录号：JX217743）重组到原核表达载体pET-32a（+）中，并转化到Escherichia coli BL21（DE3）宿主菌，经IPTG 进行诱导表达。对表达产物进行SDS-PAGE和Western blotting 检测，镍柱亲和层析纯化，并采用Brad Ford 方法测定融合蛋白浓度，黄嘌呤氧化法分析其酶活。【结果】成功的构建了原核表达载体pET-32a（+）-PpCuZnSOD，并获得分子质量约为35 kDa的诱导表达产物，纯化后融合蛋白浓度为183.7 mg·L-1，活性为5.23×103 U·mg-1。 【结论】成功构建了桃pET-32a（+）-PpCuZnSOD原核表达载体，表达量高、稳定性强，重组表达产物具有较高CuZnSOD酶活性，为桃CuZnSOD酶的进一步研究奠定了基础。

关键词： 桃； PpCuZnSOD； 原核表达； 纯化； 鉴定

中图分类号：S662.1 文献标志码：A 文章编号：1009-9980？穴2013？雪02-0185-06

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）在植物中普遍存在， 具有清除自由基、维持活性氧代谢平衡、保护膜结构的功能、延缓器官衰老过程的作用[1]。根据酶活性中心的辅基部位结合的金属离子的不同，SOD可分为3 种类型：CuZnSOD、MnSOD和FeSOD[2]，其中CuZnSOD是3种歧化酶中含量最丰富的一种，是活性氧清除酶系统中最重要的酶，具有减轻膜脂过氧化的作用。大量研究发现，提高植物体内抗氧化酶活性和增强抗氧化代谢的水平是提高植物抗逆性的有效途径[3-6]。SOD的研究受到国内外学者的广泛关注[7]。前人对草莓[8]、番荔枝[9]、桃[10]等果实成熟软化的研究表明，SOD酶活性与果实硬度密切相关；此外SOD在医疗保健方面和食品加工等方面也具有重要作用，CuZnSOD 是一种疗效广泛的药用酶，在适当的条件下，补充外源SOD能调节机体的代谢、提高人体的免疫功能，能够有效的防治某些疾病和延缓衰老，SOD作为保鲜剂、抗氧化剂以及功能食品的营养强化剂在食品加工方面也有着广阔的应用前景[11-12]。

近年来， 对几种主要模式生物SOD基因的克隆、功能分析以及蛋白质表达已进行了深入的研究[13]，在陆地棉[14]、野桑蚕[15]、杨梅[16]和珍珠粟[17]等植物中发现的CuZnSOD也实现了体外表达。笔者在桃中获得了包含完整编码区的PpCuZnSOD基因（GenBank登录号：JX217743），在此基础上，成功构建了该基因的原核表达载体pET-32a（+）-PpCuZnSOD， 并在大肠杆菌中得到高效表达，层析纯化后获得具有高活性的CuZnSOD酶，对进一步研究PpCuZnSOD基因的作用功能奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料与试剂

大肠杆菌 DH5α用于基因克隆，BL21（DE3）作为融合蛋白表达的宿主，2种大肠杆菌均为实验室保存。pGEM-PpCuZnSOD 重组质粒，PCR产物克隆的载体pGEM-T vector和DNA回收试剂盒购自TIANGEN公司，PCR Kit购自Ferments公司，TaKaRa公司的MiniBEST Plasmid KIT Purification质粒提取试剂盒，表达载体 pET-32a（+）购自Novagen，限制性内切酶BamH I和Xho I以及 T4 DNAligase均购自Fermentas；SOD 试剂盒购自南京建成生物工程研究所，Ni-NTA SefinoseTM Kit，DAB显色试剂盒购自生工生物；一抗、二抗购自北京博奥森公司。

1.2 方法

1.2.1 融合蛋白原核表达载体的构建 1）PpCuZnSOD基因CDS引物设计与PCR扩增。以克隆得到的PpCuZnSOD基因序列为模板设计桃PpCuZnSOD基因CDS的PCR引物，设计如下包含BamH I和Xho I识别位点的引物。PpCuZnSOD-F：5'-CGCGGATCCATGGTGAAGGGCGTTGCTGTT-3'，CGCGGATCC为接头序列，其中CGCG为保护碱基，GGATCC为BamH I识别位点，并包含了PpCuZnSOD的CDS的起始密码子ATG；PpCuZnSOD-R：5'-CCGCTCGAGTCAGTTTTGGAGACCAATAAT-3'。CCGCTCGAG为接头序列，其中 CCGC为保护碱基，CTCGAG为Xho I的识别位点，TCA为终止密码子TGA的反向互补序列。以PpCuZnSOD基因连接克隆到pGEM-T vector的菌液为模板，进行CDS的PCR扩增，扩增体系：上下游引物（10 μmol·L-1）各1 μL，cDNA模板1 μL，2xPCR Master Mix用12.5 μL，终体积25 μL；扩增程序为：94 ℃ 3 min， 94 ℃ 45 s， 62 ℃ 45 s， 72 ℃ 45 s， 共35个循环，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收连接后转至DH5α，挑取单菌落振荡培养菌落PCR检测后，随机挑选5个条带大小与预期相符的单菌落送公司测序。

2）质粒提取、双酶切、连接转化及检测。提取pGEM- PpCuZnSOD重组质粒及pET-32a（+）质粒，分别对pGEM-PpCuZnSOD重组质粒及pET-32a（+）进行双酶切反应：H2O19 μL，10×K buffer O 4.0 μL，质粒（重组质粒及载体）DNA15.0 μL（约10 μg），BamH I和Xho I各1 μL，37 ℃酶切3 h。

目的基因酶切产物与表达载体进行琼脂糖凝胶电泳并回收，然后进行连接，连接体系为：H2O 27 μL，ligation buffer 1.0 μL，目的基因10.0 μL，表达载体1.0 μL，T4 DNAligase1.0 μL，16 ℃过夜连接。次日将连接产物转入感受态DH5α涂板培养，获得阳性克隆后继续培养提取质粒，将其转至感受态BL21（DE3），涂板培养所得到的阳性克隆即为pET-32a（+）-PpCuZnSOD重组质粒。最后进行重组质粒的双酶切检测。

1.2.2 pET-32a（+）-PpCuZnSOD重组蛋白的诱导表达 1）样品的处理。分别从转化组和对照组的培养液中取1 mL菌液，4 000 r·min-1离心5 min，收集沉淀，加100 μL 1% SDS凝胶加样缓冲液（1.0 mol·L-1 Tris-HCl（pH 6.8），10%甘油，10%SDS，DTT，0.1%溴酚蓝），剧烈振荡悬浮，混匀后，沸水浴10 min。迅速冷却至室温，4 ℃放置，用于SDS-PAGE分析。

2）最佳IPTG诱导浓度的筛选。挑取携带有pET-32a（+）-PpCuZnSOD表达载体的BL21（DE3）单菌落培养于3 mL LB培养基（含氨苄青霉素25 mg·L-1）中，37 ℃，200 r·min-1振荡培养过夜。用含pET-32a（+）质粒的BL21（DE3）菌株作为对照。按1%（v/v）接种量转接于20 mL LB培养基中（含氨苄青霉素25 mg·L-1），振荡培养至OD600达0.7左右，加IPTG至终浓度分别为0 mmol·L-1、0.1 mmol·L-1、0.5 mmol·L-1、1.0 mmol·L-1，37 ℃，200 r·min-1震荡培养4 h。

3）最佳诱导时间的筛选。加0.5 mmol·L-1 IPTG后分别诱导0 h、2 h、4 h和6 h，用含pET-32a（+）质粒的BL21（DE3）菌株作为对照。

4）重组蛋白SDS-PAGE分析。表达蛋白的电泳分离蛋白质分离采用垂直板电泳系统，分离胶12%，浓缩胶5%，浓缩胶电压80 V，分离胶电压120 V。电泳结束后经考马斯亮兰染色，再脱色，最后拍照。

5）重组蛋白的纯化、浓度测定及活性鉴定。按Ni-NTA SefinoseTM Kit的说明进行融合蛋白的纯化操作；采用Brad ford 方法测定融合蛋白质浓度，以牛血清白蛋白（BSA）作为标准；按南京建成生物工程研究所CuZnSOD试剂盒测定表达蛋白的活性。

6）重组蛋白的Western blotting 检测。将已表达的重组蛋白pET-32a（+）-PpCuZnSOD样品经SDS-PAGE分离后转至PVDF膜上，分别用TBST和TBS洗涤，用封闭液封闭2 h，孵育一抗（在摇床上缓慢摇动2 h， 再用TBST和TBS洗涤）及二抗（在摇床上缓慢摇动2 h，再用洗涤液洗3 次），最后使用DAB显色试剂盒显色。

2 结果与分析

2.1 PpCuZnSOD基因CDS的扩增、目的产物与pGEM-T载体的连接

以pGEM-PpCuZnSOD 重组质粒的菌液为模板进行CDS的PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳如图1所示，有且仅有一条亮度很高且大小接近500 bp的条带，与理论值459 bp相符。将目的条带回收并进行pGEM-T载体连接，转化涂板后同样进行PCR检测和测序证明CDS序列正确。

2.2 pET-32a（+）-PpCuZnSOD原核表达载体的构建与表达分析

将PpCuZnSOD基因CDS与pGEM-T载体连接成功的载体进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收CDS片段， pET-32a（+）质粒同时进行双酶切，连接、转化DH5α、涂板、培养后选取阳性克隆继续培养，提取质粒，最后再转入BL21（DE3），获得阳性克隆即为pET-32a（+）-PpCuZnSOD重组载体，做菌液PCR检测结果与图1基本一致，提取重组质粒做双酶切检测，如图2所示，能够清楚地看出双酶切产物与图1的产物大小基本一致，约500 bp。泳道1为对照pET-32a（+）-PpCuZnSOD重组质粒，有2条带，上者为部分解链的环状双链态，下者为超螺旋态，双酶切残留的线性态pET-32a（+）质粒正好位于2者之间，约大于 5 000 bp，与理论值相符。PCR鉴定与双酶切鉴定的结果表明载体已构建成功，可用于后续的PpCuZnSOD原核表达研究。

获得pET-32a（+）-PpCuZnSOD重组载体后，进行相应的IPTG诱导，首先是不同浓度IPTG（0～1 mmol·L-1）诱导4 h，以筛选最佳诱导浓度，然后以最佳诱导浓度0.5 mmol·L-1诱导不同的时间（0～6 h），进行SDS-PAGE电泳，结果如图3所示，蛋白表达明显，IPTG诱导的转空表达载体pET-32a（+）的大肠杆菌在 20 kDa附近有自身诱导蛋白的表达，IPTG诱导的转入重组表达载体pET-32a（+）-PpCuZnSOD的大肠杆菌在35 kDa处出现了特异的融合蛋白（图中已标注），此外不同浓度的IPTG对该表达载体的表达影响不显著，相同浓度IPTG诱导下蛋白的表达量会随着诱导时间的延长而缓慢增加，但上升趋势也不是很明显。结果说明pET-32a（+）-PpCuZnSOD重组载体在大肠杆菌中成功表达，并且容易诱导，只需要0.1 mmol·L-1的IPTG诱导2 h即可。

参照生工生物公司的Ni-NTA SefinoseTM Kit说明书对所表达蛋白进行纯化，得到较纯的融合蛋白条带采用Brad ford 方法测定融合蛋白质浓度，以牛血清白蛋白（BSA）作为标准，设置不同梯度，制作标准曲线3次测定吸光值，计算所得纯化蛋白的浓度约为183.7 mg·L-1。

分别取未纯化蛋白和纯化蛋白10 μL（加上样缓冲液10 μL，共20 μL），进行Western blotting 分析进一步验证了pET-32a（+）-PpCuZnSOD在大肠杆菌中得到了正确的表达。利用南京建成生物工程研究所的CuZnSOD试剂盒测得纯化蛋白的活性约为5.23×103 U·mg-1，这说明该基因在大肠杆菌中实现了高效表达。

3 讨 论

大量研究表明，果实成熟衰老与活性氧代谢有关，在果实后熟衰老时明显增加，可能是调节果实成熟衰老的一种重要的自由基[18-19]，而SOD恰恰可以清除这种自由基；在植物中过量表达CuZnSOD 能提高植物的抗逆性[20]。而如何实现SOD相关基因的体外表达，甚至实现工业生产是很多人关注的问题，所以长久以来，前人们做了很多这方面的工作并且取得了一定的成绩。在西红柿[21]、杨梅[22]和海湾扇贝[23]中都获得CuZnSOD的体外表达蛋白，并且体外活性分别达到3×105 U·L-1和1.013×106 U·L-1培养基以及1015.36 U·mg-1；在以模式植物为代表的烟草[24]和拟南芥[25]等植物中都获得MnSOD的体外表达，此外还有部分植物FeSOD的体外表达[26]。

桃本身作为呼吸跃变型果实，呼吸高峰之后果实质地发生明显改变，果肉腐烂，针对这种现象，笔者利用表达载体pET-32a（+）成功表达了PpCuZnSOD基因的融合蛋白，并实现了对融合蛋白的分离纯化和活性鉴定，这为系统研究 PpCuZnSOD基因的作用功能、系统进化积累了一定的经验， 也为后续利用该基因进行植物遗传转化奠定了基础。

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