HPLC法测定菊苣根中咖啡因含量及其抑菌活性的研究

纪 可，邱芳萍，杜 林，邢 燕

(长春工业大学化学与生命科学学院，吉林长春130012)

菊苣为菊科菊苣属多年生草本植物，我国主要分布于西北、东北各省。菊苣根粉可用做冲剂，有健胃、消食和去脂等药理功效［1－2］，《中国大药典》记载菊苣根部含大量有效的活性成分，如类黄酮、苷类等。但对其化学成分的研究及对其提取物的药理活性方面的研究未见报道［3］。由于粉碎后沸水煮时有淡淡的咖啡香，并且有提神醒脑的功效，常被当地居民当做饮料饮用。但大部分菊苣根茎仍被当做废弃物丢掉，资源严重浪费。咖啡因是菊苣根中一种重要的营养成分，目前国内外尚未见对菊苣根中咖啡因及其抑菌性关系的研究报道。少量的咖啡因可使身心处于兴奋状态［4］，刺激机体的中枢神经系统，增高机体血糖水平，集中注意力［5］;可作为中枢神经系统的兴奋药剂，能促进胃液分泌和治疗偏头痛等疾病［6］，并有良好的抑菌效果［7］，在机体的多个系统中发挥着广泛的作用，研究和开发天然咖啡因已成为食品药品界的研究热点。所以，从废弃的菊苣根中提取的天然咖啡因替代合成的咖啡因，添加到咖啡饮品中或制成天然植物型抑菌剂等，具有天然性、安全性和功能性，在食品，药学等方面有着巨大的应用潜力，市场前景广阔。本实验以咖啡因标准品为对照，采用紫外全波长扫描，红外图谱，高效液相色谱法对菊苣根中咖啡因进行分析检测，考察了菊苣根咖啡因提取物性质及结构与标准品的相关性，并采用一系列真菌和细菌，对菊苣根咖啡因提取物的抑菌作用进行分析，为更好地应用菊苣根中咖啡因提供参考依据，为菊苣根茎的综合利用提供更为广阔的市场前景。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

乙醇、乙酸 国产分析纯;甲醇、N－N－二甲基甲酰胺 色谱纯;牛肉膏、蛋白胨、琼脂;菊苣根 吉林省和龙市东胜乡;咖啡因对照品 天津一方科技有限公司。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠埃希菌(Escherichia coli);青 霉 菌(Penicillium sp)、酿 酒 酵 母(Saccharomyces cerevisiae) 长春工业大学化学与生命科学学院生物实验室提供。

日普利RPL－D2000 COLUMN HBATER高效液相色谱仪 配LC－1000D型紫外－可见光检测器，山东鲁南瑞虹化工仪器有限公司;UV1102紫外分光光度计 上海棱普仪器仪表有限公司;Specturm One红外线光谱仪 美国PE仪器公司;YXQ－LS立式压力蒸汽灭菌器 上海申安机械厂;MJX－250培养箱 吉林省医疗器械厂。

1.2 实验方法

1.2.1 色谱条件 色谱柱:C18色谱柱(250mm×4.5mm，20μL);流动相:甲醇∶水∶乙酸∶N－N－二甲基甲酰 =30∶70∶0.05∶0.25;柱温:25℃;检测波长:274nm;流速:1mL/min;进样量:10μL。

1.2.2 标准液的配制 精密称取咖啡因标准品5mg，用甲醇∶水=70∶30的混合溶液溶解并定容于10mL容量瓶中，分别移取 0.5、1.0、1.5、2、2.5mL 的标准液分别定容于10mL容量瓶中，超声波脱气10min后再通过0.45μm 水系膜过滤［8］，进样量为 10μL，以咖啡因质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

1.2.3 样品前处理 将原材料洗净后切成片，烘干后粉碎，过60目筛，用浓度为85%的乙醇按料液比为1∶20的比例在索氏提取器中提取，过滤，以6000r/min转速离心10min后减压浓缩得提取物浸膏，置于烘箱中烘干备用。

称取适量烘干后提取物，加200.0g/L的亚铁氰化钾溶液2.0mL和200.0g/L的碱式乙酸铅溶液2.0mL除去菊苣根中的蛋白质［9］，过滤，滤液超声脱气后备用。配制浓度为4mg/mL的样液［10］，然后用0.45μm滤膜过滤，作为待测样液，在色谱条件下，进样3次，求出峰面积平均值，计算咖啡因含量。

1.2.4 检测波长的选择 以蒸馏水为空白，在190～1000nm波长范围内分别对咖啡因标准品和菊苣根咖啡因提取物进行紫外全波长扫描［11］，观察最大吸收波长。

1.2.5 咖啡因的检识 称取7.3g碘化铋钾，加冰醋酸10mL后用60mL蒸馏水溶解，制成检识液，向待测样液中滴加2滴检识液，观察现象。

1.2.6 咖啡因红外图谱检测 分别将干燥的咖啡因标准品与菊苣根咖啡因提取物粉末与溴化钾混合在玛瑙研钵中研磨均匀，经压片成薄片，在4000～400nm波长范围内进行红外光谱扫描，观察谱峰情况。

1.2.7 菊苣根咖啡因提取物抑菌活性的研究 将培养基制成平板［12］，酵母和霉菌用马铃薯培养基，细菌用牛肉膏蛋白胨培养基，各菌种用无菌生理盐水配制成107～108CFU/mL孢子悬液，吸取0.2mL孢子悬液均匀涂抹到灭菌的平板上，将3片浸有菊苣根咖啡因提取物的滤纸片均匀贴在每个涂有菌液的平板上，酵母和霉菌培养在28℃下48h，细菌培养在36℃下24h。以无菌水做空白对照，观察抑菌效果，测定抑菌圈直径。以上操作均在无菌条件下进行。

2 结果与分析

2.1 检测波长的选择

按1.2.4步骤操作，二者均在274nm处有最大吸收波长，此处为生物碱络合物的特征吸收峰(如图1)。280nm处无紫外吸收，说明无蛋白质吸收峰，在260nm处无吸收峰，说明无核酸存在。故选择咖啡因检测波长为274nm。

图1 紫外光谱分析结果图Fig.1 The UV spectral analysis result

2.2 咖啡因的检识结果

按1.2.5步骤操作，当向待测液中滴加2滴检识液后，烧杯中出现难溶的橙红色络合物，表明试样液中存在咖啡因成分的。

2.3 咖啡因的红外光谱图分析

菊苣根咖啡因提取物红外光谱图(图3)经数据库检索后与咖啡因标准品红外图谱(图2)特征峰基本符合，图谱解析如下:3424cm－1为酰胺键中N－H的伸缩振动产生的吸收峰;2963cm－1为甲基的C－H伸缩振动产生的吸收峰;1659cm－1为碳碳双键－C=C－伸缩振动产生;1653cm－1为叔酰胺中－C=0的伸缩振动产生;1431cm－1为甲基的C－H弯曲振动产生，由于氮原子与甲基相连，吸收带向高波数位移明显;C－N 伸缩振动位于 1350～1100cm－1，与芳环碳或不饱和碳相连的C－N伸缩振动位于1350～1250cm－1，咖啡因结构中C－N还连有甲基，甲基是供电子基，使C－N向高波数位移。由谱图可知待测物结构中含有以上特征基团，与国家药典文献报道的咖啡因结构中的基团一致［13］。

图2 咖啡因标准品红外图谱Fig.2 IR spectra of caffeine standard

图3 菊苣根咖啡因提取物红外图谱Fig.3 IR spectra of caffeine extract ion of chicory root

2.4 标准曲线的绘制

由图4、图5可知，纯品咖啡因的保留时间为3.787min，得到回归方程为 y=32199x－1.4E+5，R2=0.9995，表明咖啡因进样量在25～125μg/mL范围内有良好的线性关系。

图4 咖啡因标准品HPLC色谱图Fig.4 HPLC chromatogram of caffeine standard

图5 咖啡因标准曲线Fig.5 Caffeine standard curve

2.5 样品分析

菊苣根咖啡因提取物色谱图(见图6)保留时间为3.79min，与标准品保留时间基本一致，证明样品中存在咖啡因，根据高效液相定量结果所得菊苣根咖啡因含量为2.14mg/g。

2.6 重现性测定

取样品5份，按照提取工艺制备样品溶液，在上述色谱条件下进行测定，结果表明该方法重现性良好，计算RSD值为0.272%。

2.7 回收率实验

图6 菊苣根提取物HPLC色谱图Fig.6 HPLC chromatogram of caffeine extraction

同一样品分别精密加入不同量咖啡因标品，按上述色谱条件测定回收率，详见表1。结果表明，回收率在97.9%～100.9%之间，相对标准偏差RSD为0.621%。

表1 回收率实验Table 1 Recovery experiment

2.8 稳定性实验

取同一浓度样品按上述色谱条件，分别在0、1、2、3、4h取10μL进样，分析结果表明，咖啡因提取物在4h之内峰面积变化很小，稳定性良好，其相对标准偏差RSD=0.92%。详见表2。

表2 样品稳定性实验结果Table 2 Experiment results of the sample stability

2.9 菊苣根咖啡因提取物的抑菌活性

通过5次平行实验，由表3可见提取物对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的抑制作用最强，抑菌直径可达到27mm;对大肠埃希菌(Echerichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、酿酒酵母(Saccharomyces)和青霉菌(Penicillium sp.)均有较强的抑制作用，抑菌直径在18～24mm。由此可以说明菊苣根咖啡因提取物对5种常见的污染食品菌均有良好抑制作用。

3 结论

伴随着生活条件的提高，人们对健康越来越重视，人们对绿色食品的追求愈加强烈，菊苣已经成为国际上热门的功能性食品。本研究利通过紫外全波长扫描确定咖啡因在274nm处有最大吸收波长，利用红外图谱与高效液相色谱法对菊苣根咖啡因提取物进行定性及定量分析，结果表明该方法所得产品的性质及结构与咖啡因标准品结构基本吻合。该方法具有操作快速、简便、精密度好、准确度高的特点，为今后菊苣根咖啡因大规模生产及其产品的深加工提供了可行性依据，对菊苣根综合利用及功能性产品的开发具有潜在的工业生产和应用价值。

表3 菊苣根咖啡因提取物抑菌效果Table 3 Antibacteria effect of caffeine extraction of chicory root

用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠埃希菌(Echerichia coli);青 霉 菌(Penicillium sp)、酿 酒 酵 母(Saccharomyces)检验菊苣根咖啡因提取物抑菌活性，结果表明菊苣根咖啡因提取物对5种常见的污染食品菌均有良好的拮抗作用，为开发天然、温和、安全、高效、绿色的食品防腐剂的研究奠定了基础，具有很好的开发前景。由于本实验中菊苣根咖啡因提取物未经纯化分离，因此不排除与菊苣根乙醇提取物中其他的抗菌物质具有协同增效作用。

［1］何轶，郭亚健，高云艳.菊苣根化学成分的研究［J］.中国中药，2002，27(3):210－212.

［2］Sanderson M A.Nutritive value of chicory and English plantain forage Crop Science［J］.Crop Science Society of America，2003，43(5):1747－1804.

［3］罗惠善.人工栽培菊苣根水提取物的降压、利尿作用的研究［J］.中华实用医药，2010，29(5):124－152.

［4］Fredholm BB，Battig K，Holman J，et al.Actions of caffeine in the brain with special reference to factors that contribute to its widespread use［J］.Pharmacol Rev，1999，51(1):82－133.

［5］Brice C，Smith A.The effects of caffeine on simulated driving，subjective alertness and sustained attention［J］.Hum Psychopharmacol，2001，16(7):523－531.

［6］Smith A P，Maben A，Brockman P.The effects of caffeine and evening meals on sleep and performance，mood and cardiovascular functioning the following day［J］.J Psychopharmacol，1993，7:203－206.

［7］严赞开.咖啡因的抑菌实验［J］.中国农学通报，2004，20(3):65－66.

［8］侯冬岩，回瑞华.高效液相色谱法测定黑茶中咖啡因含量［J］.食品科学，2009，30(20):283－285.

［9］邵金良，黎其万.离心萃取法测定茶叶中的咖啡因［J］.食品与机械，2010，26(4):78－80.

［10］刘晓庚，朱珊.茶叶中咖啡因提取方法的比较［J］.中国食品添加剂，2010(4):83－87.

［11］杨言言，张铁铭.紫外分光光度法测定安徽罗汉尖老茶中咖啡因含量［J］.安徽中医学院学报，2012，31(3):72－73.

［12］黄秀梨.微生物学实验指导［M］.北京:高等教育出版社，1994:35－115.

［13］中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国药典［S］.第二部.北京:中国医药科技出版社，2010:461－462.