酒花原花青素抗氧化性能研究

王金晶，单 岩，刘春凤，李 崎，*

（1.啤酒生物发酵工程国家重点实验室（筹），山东青岛266061；2.江南大学工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡214122）

酒花是啤酒酿造的重要原料，被誉为“啤酒的灵魂”，赋予啤酒独特的苦味和香气，对啤酒的抗氧化性有重要意义[1]。与葡萄籽一样，酒花中含有许多酚类物质，其中原花青素类化合物能够影响啤酒的风味、酒体的收敛性、新鲜度以及非生物稳定性。同时，原花青素类化合物具有抗氧化、保护心血管等药用价值[2]，可以帮助降血脂、血糖，预防氮氧相关性疾病，例如阿尔茨海默氏病和帕金森氏病[3-4]。原花青素（Oligomeric Proanthocyanidins，OPC）作为自然界广泛存在的一类酚类化物的总称，根据不同单体之间的连接及聚合度（DP）不同，分为低聚原花青素（DP为1～5）和高聚原花青素（DP为6～10）。经研究发现，在啤酒中原花色素二聚体主要为原花青素B3，而主要的三聚体为原翠雀素，尽管并未发现聚合度在四以上的低聚物，但是通过对经Sephadex LH-20提纯后的原花青素提取物计算平均聚合度，发现了平均聚合度在6以上的混合物[5]。本研究将酒花中原花青素提纯并进行聚合度分级，研究不同聚合度的原花青素的抗氧化性能，为解释啤酒的抗老化机理提供一些依据。同时，作为酒花中的主要成分之一，原花青素类化合物突出的抗氧化性能，也为其在不同领域的进一步应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

（+）-儿茶素标准品 美国sigma公司；供试样品颗粒酒花 玉门拓璞酒花公司。

ALL04型电子天平 梅特勒；BSZ-100型自动部分收集器 上海沪西分析仪器厂；UV-2000型紫外分光光度计 UNICO；HB-10型旋转蒸发仪 德国IKA公司；HDL型组合式紫外检测器 上海金达生化仪器有限公司；HHS型电热恒温水浴锅 上海博讯实业有限公司；HPX-180BS-II型恒温培养箱 上海博迅实业有限公司。

1.2 原花青素平均聚合度（DP）的测定

1.2.1 原花青素提取纯化及含量测定 酒花中原花青素的提取纯化参考本实验室原花青素提取方法[6]。原花青素含量采用改良的香草醛-浓盐酸法测定[7]。取待测液1mL，依次加入香草醛-甲醇溶液3mL，浓盐酸1.5mL，混匀后于20℃水浴15min，500nm处测吸光度，以1mL甲醇代替待测液作为空白对照。整个操作过程避光进行。以香草醛-浓盐酸法测得的吸光值绘制标准曲线。

1.2.2 平均聚合度的计算 原花青素质量采用浓盐酸-香草醛法测得，物质的量采用改良香草醛法测得，选用儿茶素为标准物，摩尔质量为308.28g/mol。原花青素平均聚合度以下公式计算：

式中，DP为平均聚合度；m为原花青素质量，μg；n为同质量的原花青素物质的量，μmol；M为标准曲线所用标准物的摩尔质量，g/mol。

1.2.3 原花青素平均聚合度的分级 酒花经有机溶剂萃取、AB-8大孔吸附树脂初步纯化后，得到的原花青素粗提液经旋转蒸发浓缩后记为P0，按图1所示流程对P0进行原花青素平均聚合度的分级，并将分级所得到的物质分别记为P1～Pn，其中，提高氯仿浓度不再产生沉淀，则剩余液体经旋转浓缩后记为Pn。

图1 酒花原花青素聚合度分级流程Fig.1 Fractionation of hop proanthocyanidins according to degree of polymerization

1.3 原花青素抗氧化性能研究

1.3.1 还原能力的检测 取1.0mL原花青素水溶液（50～250μg/mL），加入磷酸盐缓冲液（0.2mol/L，pH=6.6）和1%铁氰化钾各1.0mL，于50℃水浴20min，冰浴冷却后加入1.0mL 10%TCA溶液，6000r/min离心4min，取上清液2.5mL，加入2.0mL去离子水后再加入0.5mL 0.1%FeCl3溶液，静置10min后于700nm下测定吸光度值A700[8]。

1.3.2 羟基自由基[·OH]清除率的测定 在0.8mL的KH2PO4-NaOH（0.1mol/L，pH=7.5）缓冲液中，加入0.2mL浓度为10～50μg/mL的原花青素水溶液，然后依次加入1mmol/L EDTA、10mmol/L H2O2、60mmol/L 2-脱氧-D核糖、2mmol/L抗坏血酸、1mol/L FeCl3各0.2mL，混合均匀后于37℃水浴60min，依次加入20%三氯乙酸和1%TBA各2mL，快速混匀沸水浴15min后，冰浴冷却，于532nm下测定吸光度A532[9]。

1.3.3 抑制脂质体过氧化能力的检测 将4.0g大豆卵磷脂分散于500mL水中，20kHz超声处理30min，冰浴冷却制得人工脂质体。将原花青素样品配制成10、20、30μg/mL水溶液，加100μL样品到盛有9.9mL人工脂质体的50mL三角瓶中，再加入20μL 10mmol/L乙酸铜，混匀后避光条件下于31℃摇床100r/min进行开口氧化实验。每12h取样测定一次，同时，以水代替样品做空白[10-12]。通过测定脂质体氧化过程中两种反应产物共轭二烯过氧化物和丙二醛的含量和出现峰值的时间长短评价原花青素样品的抗氧化能力。

1.3.3.1 共轭二烯过氧化物（CD-POV）产量的测定

取0.1mL氧化液，加入4.9mL甲醇，于234nm下测定紫外吸收值，所测值减去0时刻值即为CD-POV的吸光值，同时以甲醇做参比。以摩尔消光系数ε=26000mol/L-1·cm-1计算脂质体中CD-POV的产量（μmol/L）。

式中，A：吸光度值；C：溶液浓度；L：液层厚度。

1.3.3.2 TBA法测定丙二醛（MDA） 0.3mL氧化液加入3.0mL 0.5%的TBA（2-硫代巴比妥酸），TBA以10%三氯乙酸为溶剂，沸水浴15min，6000r/min离心4min后，于532nm处测定吸光值，同时以去离子水做参比。以摩尔消光系数ε=1.56×105mol/（L·cm）计算脂质体中MDA的产量（μmol/L）。

1.3.4 亚油酸体系中抗氧化能力检测 在1.0mL浓度为5μg/mL和10μg/mL的原花青素水溶液中加入2.0mL 0.05mol/L pH7.0的磷酸盐缓冲液、1.0mL含2.5%（v/v）亚油酸的无水乙醇溶液，1.0mL蒸馏水，混匀后，密封并避光置于40℃恒温箱中反应，以乙醇做空白。

在4.85mL 75%的乙醇中加入50μL亚油酸乳化液，混匀后加入30%的硫氰酸氨和0.02mol/L的氯化亚铁溶液（含3.5%盐酸）各50μL，3min后于500nm下测定反应液的吸光度，亚油酸氧化程度以A500表示。t时刻的过氧化值以t-t0表示[11，13]，其中t0为0时刻的过氧化值，每2h测定一次。用氧化抑制率来评价不同聚合度的原花青素的抗氧化性能，以反应240h时的氧化程度计算各样品的抗氧化能力，抑制率（%）公式为：

2 结果与讨论

2.1 酒花中原花青素平均聚合度（DP）的分级

酒花原花青素（OPC）结构复杂，由于受现阶段分离提纯条件的限制，所得到的化合物并非全部的酒花原花青素，因此利用酒花中原花青素的结构变化来研究其生理活性并不可行。根据前期的研究发现，聚合度的大小能够影响OPC的生理活性，各大组分的主体聚合度与平均聚合度趋势是一样的，因而平均聚合度法可用于研究原花青素的构效关系[14]。

以2011年8月产哥伦布颗粒酒花为原料，经有机溶剂萃取和AB-8树脂粗提，提取液经旋转蒸发浓缩记为P0，P0按图1流程进行平均聚合度的分级，得到的原花青素平均聚合度如表1所示。

表1 不同酒花原花青素的平均聚合度Table 1 The average polymerization degree of different prothocyanidins fractions

2.2 酒花原花青素抗氧化活性研究

由于原花青素具有特殊保健作用及其在抗氧化性方面的特殊贡献，对酒花中原花青素进行抗氧化活性研究不仅对啤酒及其酿造原料有重大意义，且使得人们对啤酒有更深一步了解，扩大了酒花的应用范围，使其在保健方面发挥更大的作用。

2.2.1 不同聚合度原花青素还原能力的检测 原花青素的还原能力是确定其潜在的抗氧化性能的重要指标。作为还原剂，将铁氰化钾中的Fe3+转换成Fe2+，形成亚铁氰化钾，亚铁氰化钾中的Fe2+再与Fe3+形成普鲁士蓝，因而，在700nm下，还原能力越强，吸光度值越大。

图2 原花青素还原能力Fig.2 Reducing capacity of proanthocyanidins

如图2所示，随着样品浓度的增加，其还原能力逐渐增大，对于大多数物质而言，当浓度达到200μg/mL之后，吸光值增加幅度趋缓。将不同聚合度的酒花原花青素、（+）-儿茶素和抗坏血酸进行比较，抗坏血酸的还原能力仅高于DP为5.55的原花青素，而低于聚合度为1.51、2.56、2.97、3.50、3.83的原花青素。在浓度50～100μg/mL范围内，聚合度1.51、2.56、2.97、3.50、3.83之间的原花青素还原能力相差不大，随着浓度的增大，其还原能力差别明显，浓度达到250μg/mL时，（+）-儿茶素还原能力在其他低聚体之下。由此可以看出，各物质还原能力由强到弱依次为：DP为1.51、2.56、2.97、3.50、3.83的原花青素＞（+）-儿茶素＞抗坏血酸＞DP为5.55的原花青素。

2.2.2 羟基自由基清除能力的测定 [·OH]是对生物毒性最强、危害最大的自由基之一。[·OH]几乎可与所有的生物大分子发生反应，[·OH]的存在，不仅对啤酒的老化有很大的影响，而且羟基自由基会影响人体皮肤的老化，与人类衰老、癌症产生等有关[15]。因此，清除羟基自由基的能力可以作为表示抗氧化性能强弱的重要指标。然而，[·OH]化学性质活泼，且与物质反应时间很短，在生物体内难以直接检测，现多用Fenton反应体外模拟[·OH]的产生，然后利用荧光法、分光光度法、气相色谱法等检测。本研究采用2-脱氧-D-核糖分光光度法检测，该法的原理为：抗坏血酸、Fe2+及H2O2生成[·OH]，然后[·OH]使2-脱氧-D-核糖降解，脱氧核糖在酸性环境中降解生成丙二醛与TBA反应，形成粉红色物质，在532nm处有最大吸收峰。对羟基自由基的清除效果越强，则脱氧核糖降解越少，因而吸光值也越小[16]。如图3所示，对2-脱氧-D-核糖体系中的羟基自由基的清除效果与不同聚合度的酒花原花青素的浓度相关，清除效果随着样品的浓度增加逐渐加强。在原花青素中，对其抗氧化性贡献最大的主要活性基团是酚羟基，而单个原花青素分子中的酚羟基数量随着原花青素聚合度的增加增多，由此，相同浓度的原花青素对[·OH]清除效果，随着平均聚合度的增加逐渐增强。在高浓度时（50μg/mL），不同聚合度的原花青素对[·OH]的清除率均在5%以上，其中，聚合度为5.55的聚合物对[·OH]清除率达到20%。可能是由于原花青素与[·OH]的反应，减少了脱氧核糖与[·OH]

图3 不同原花青素样品清除羟基自由基[·OH]能力Fig.3 The scavenging capability of different proanthocyanidins to hydroxyl radicals

结合的机会，降低了脱氧核糖的降解率。原花青素聚合度越低，清除[·OH]的能力就越弱，其原因可能是因为在脱氧核糖体系中，如果反应物的还原能力很强，将Fe3+还原为Fe2+，且还原能力比与[·OH]反应的能力大，此时脱氧核糖就会与[·OH]反应，增加了脱氧核糖的降解，使吸光度增大，表现为对[·OH]清除效果越弱[16]。由此可见，原花青素的抗氧化性能与其分子结构及其所处的反应体系密切相关。

2.2.3 抑制脂质体过氧化能力的研究 生物体中不饱和脂肪酸的氧化过程主要分为两个阶段。第一阶段，不饱和脂肪酸氧化生成共轭二烯氢过氧化物（CD-POV），但是由于CD-POV并不稳定，会进一步氧化生成环氧化物，最终生成次级氧化产物——丙二醛（MDA）。CD-POV氧化分解的速度随着氧化程度的加深而加快，当CD-POV浓度达到最大后，随着时间的加长，CD-POV浓度降低，氧化分解为次级产物MDA。因而，相同时间段内二者含量越高或二者出现的峰值时间越短，说明抗氧化能力越弱。CD-POV的吸收峰在234nm，MDA产物与TBA反应后吸收峰在532nm，在人工脂质体过氧化过程中添加不同聚合度的原花青素样品、（+）-儿茶素和抗坏血酸，检测CDPOV、MDA与TBA反应后的产物的峰值，研究不同抗氧化剂对人工脂质体过氧化过程的抑制作用。如图4所示，不同聚合度的酒花原花青素对脂质体的氧化过程均有一定的抑制作用。

图4 不同样品抑制脂质过氧化能力（234nm）Fig.4 Antioxidant activity of different samples in the phospholipid liposome suspension at 234nm

在40h以内，氧化反应所产生的吸光值均随着时间的延长而增大。随着原花青素浓度的升高，吸光值略有下降，说明脂质体过氧化过程的抑制作用存在一定的浓度效应。随着时间的延长，CD-POV进一步氧化分解为MDA，吸光值下降，当反应时间达到80h以后，第二阶段反应基本达到动态平衡状态，吸光值维持稳定。多数原花青素低聚物出现最大吸收峰的时间要长于抗坏血酸和空白组，说明酒花原花青素对人工脂质体的抗氧化性能要强于抗坏血酸。

图5 不同样品抑制脂质过氧化能力（532nm）Fig.5 Antioxidant activity of different samples in the phospholipid liposome suspension at 532nm

CD-POV进一步氧化产生的MDA与TBA在酸性条件下反应生成粉红色物质，于532nm下显色。吸光值越大，氧化产物越多，脂质体被氧化程度越大，抗氧化剂的抗氧化效果越弱。图5是不同浓度的样品在不同时间点对脂质体抗氧化效果的TBA测定结果。从图5可以看出，所有抗氧化剂的添加对抑制脂质体氧化均有效果，图5中显示为出峰时间的推迟和峰强度的减弱，并且随着添加浓度的增加，抗氧化效果增强。抗氧化剂根据其抗氧化性质不同分为预防性抗氧化剂和脂质过氧化链式反应的阻断剂，前者通过清除过氧化启动阶段引发自由基产生的物质，后者通过捕捉过氧化产生的自由基，缩短反应链长度，从而减缓或阻断脂质过氧化进行[16]。酒花原花青素在人工脂质体体系中，产生过氧化物的诱导时间与空白相似，但峰值较空白低。原花青素分子结构中存在酚羟基，由此说明，酒花原花青素低聚物在此反应中，主要作为脂质过氧化链式反应的阻断剂。另外，Cu2+除作为反应催化剂外，还能与原花青素螯合，有助于延缓脂质体的氧化。综合图4和图5可以发现，当添加量为30μg/mL时，DP为2.97和3.50的原花青素在人工脂质体体系中的抗氧化性能较其他的聚合度的原花青素好。

2.2.4 原花青素在亚油酸体系中抗氧化能力测定 亚油酸体系是评价食品中抗氧化剂作用最常用的检测体系。含有不饱和脂肪酸的油脂，在各种条件的催化下，会将氯化亚铁中的Fe2+氧化成Fe3+，在硫氰酸铵的作用下于500nm波长下显色。吸光值越高，说明氧化作用越强，抗氧化能力越弱。随着反应时间的延长，反应产生的过氧化物逐步分解成小分子物质，因而，反应一段时间后，吸光值会下降。

图6 亚油酸体系中样品的抗氧化效果Fig.6 Antioxidant effect of samples in the linoleic acid system

在亚油酸体系中分别添加5μg/mL和10μg/mL样品，体系中的样品抗氧化效果如图6所示。在氧化时间超过120h以后，空白组的吸光值明显增加，说明此时亚油酸体系的自氧化作用明显增强。在添加了不同聚合度的原花青素和抗坏血酸的体系中，其吸光值均低于同一时间的空白体系，说明原花青素低聚物和抗坏血酸均能有效地抑制亚油酸的自氧化作用。不论是原花青素还是抗坏血酸，随着添加量的增大，抑制作用增强，说明抗氧化剂对亚油酸的抗氧化作用具有一定的剂量效应。当添加量较低时，DP为2.56的原花青素抗氧化效果最好，儿茶素次之，DP为3.5左右的原花青素对亚油酸体系自氧化抑制效果最差，而抗坏血酸则居中。如图6（b）所示，当添加量为10μg/mL，各物质抑制亚油酸体系自氧化有明显区别，其中，抗坏血酸抑制效果最差。酒花原花青素在亚油酸体系中有很好的抗氧化性。从图6中可以看出，抑制亚油酸体系自氧化能力的强弱与原花青素平均聚合度的大小并无必然联系，（+）-儿茶素作为单酚，其抗氧化效果一般，低于部分原花青素低聚物。在样品为5μg/mL时，DP为2.56抗氧化能力最强，在样品浓度为10μg/mL时，DP为2.56、3.83、2.97和5.55的聚合物均有效好的抑制自氧化效果，由此推测原花青素的在亚油酸体系中的抗氧化性可能与聚合度大小并无太大关系，而与聚合物中所含具体物质有关，在原花青素聚合物中存在某种物质对亚油酸的氧化有很强的抑制作用，但目前还未有报道。

3 结论

利用经有机溶剂萃取和AB-8树脂粗提的原花青素进行聚合度分级，共得到平均聚合度为1.51、2.01、2.56、2.97、3.50、3.83和5.55的七种原花青素聚合物。对这七种物质进行抗氧化性能实验，不同聚合度的酒花原花青素在几组实验中表现出良好的抗氧化性能，其还原能力由强到弱依次为：DP为1.5～4.0的原花青素＞（+）-儿茶素＞抗坏血酸＞DP为5.55的原花青素。不同聚合度的酒花原花青素均能清除脱氧核糖体系中的[·HO]，清除效果随样品浓度的增加逐渐加强，DP为5.55的聚合物对清除效果最佳。原花青素对人工脂质体的氧化有明显的抑制作用，当添加量为30μg/mL时，DP为2.97和3.50的原花青素抗氧化性能较其他的聚合度的原花青素好。在亚油酸体系中，原花青素和抗坏血酸均能有效地抑制亚油酸的自氧化作用，但与其聚合度高低不存在必然关系。

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