典型性甲基供体对脱氮假单胞杆菌代谢过程的氧调控作用

周 佳，程 新，彭志远，彭卫福，李昆太

(江西农业大学生物科学与工程学院，江西南昌330045)

维生素B12系钴胺素类(cobalamin)化合物，它是一种重要的生物活性物质，可以用来治疗恶性贫血症，同时它也是许多微生物和动物的生长因子［1］。由于维生素B12的化学合成步骤过于复杂，目前几乎都是通过脱氮假单胞杆菌(Pseudomonas denitrificans)、谢氏丙酸杆菌(Propionibacterium shermanii)和费氏丙酸杆菌(Propionibacterium freudenreichii)等微生物的发酵来生产维生素B［2］12。由于维生素B12产率高，有关脱氮假单胞杆菌的应用研究更是成为人们当前所关注的热点。脱氮假单胞杆菌生物合成维生素B12的过程共涉及八步甲基化反应［3］，尽管这些甲基化反应均是由S-腺苷-L-甲硫氨酸提供甲基参与完成，但是甲硫氨酸上的甲基往往来源于外源甲基供体。首先，甜菜碱(N，N，N-三甲基甘氨酸)在甜菜碱高半胱氨酸甲基转移酶(BetainehomocysteineS-methyltransferase，BHMT)的催化下向高半胱氨酸转移一个甲基，分别形成二甲基甘氨酸和甲硫氨酸［4-5］;甲硫氨酸进一步通过甲硫氨酸腺苷转移酶(methionine adenosyltransferase)催化形成S-腺苷-L-甲硫氨酸，所生成的S-腺苷-L-甲硫氨酸最终参与到维生素B12合成途径中的甲基化反应过程。和甜菜碱一样，氯化胆碱分子中也含有三个甲基［6］，它可逐步通过胆碱脱氢酶(choline dehydrogenase)和甘氨酸甜菜碱醛脱氢酶(glycine betaine aldehyde dehydrogenase)的催化生成甜菜碱，所生成的甜菜碱再进一步参与到S-腺苷-L-甲硫氨酸的合成反应中［7］。由此可见，在脱氮假单胞杆菌合成维生素B12的过程中，甜菜碱和氯化胆碱是十分重要的外源甲基供体。多项研究也表明，发酵培养基中加入甜菜碱和氯化胆碱能够大大促进脱氮假单胞杆菌合成维生素B［8-11］12。然而，目前很少有文献报道这两种典型性甲基供体会对脱氮假单胞杆菌的代谢过程产生怎样的影响。基于此，本文在7L发酵罐中分别以甜菜碱和氯化胆碱为甲基供体，考察了这两种甲基供体下的菌体代谢过程变化，结果发现二者会对脱氮假单胞杆菌发酵过程产生截然不同的氧调控作用。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

脱氮假单胞杆菌(Pseudomonas denitrificans)由本实验室保存;蔗糖、甜菜碱、氯化胆碱、5，6-二甲基苯并咪唑、CoCl2·6H2O、硫酸铵等试剂 均为国产分析纯。

8453型紫外-可见分光光度计 Agilent公司;HP 1100型色谱仪 Agilent公司;7-L全自动发酵罐镇江东方生物工程设备技术有限责任公司等。

1.2 培养基

斜面培养基(g/L):蔗糖 20、玉米浆 10、(NH4)2SO40.25、(NH4)2HPO41.5、MnSO4·H2O 0.1、ZnSO4·7H2O 0.1、琼脂 20，pH7.0～7.2。

种子培养基(g/L):蔗糖30、玉米浆10、KH2PO45、(NH4)2SO42.3、(NH4)2HPO40.7、MnSO4·H2O 0.2、MgSO41.5、ZnSO4·7H2O 0.02、CoCl2·6H2O 0.02、5，6-二甲基苯并咪唑0.0045，pH7.2～7.4。

发酵培养基(g/L):蔗糖80、玉米浆30、甜菜碱/氯化胆碱 15、(NH4)2SO42、MgSO41.5、KH2PO40.75、ZnSO4·7H2O 0.08、CoCl2·6H2O，0.14、5，6-二甲基苯并咪唑 0.075，pH7.2～7.4。

1.3 发酵方法

1.3.1 斜面培养 从-20℃的冰箱中取出保藏好的甘油管菌种，接种于配制好的斜面，置于28℃恒温培养箱培养48h。

1.3.2 摇瓶种子培养 每支新鲜的斜面以10mL无菌水洗下菌体，制成菌悬液。取菌悬液1mL接至装量为60mL/300mL三角瓶的种子培养基中，32℃在摇床上振荡(260r/min)培养至菌体光密度值(OD700)为 9～10。

1.3.3 7-L发酵罐上发酵培养 将500mL菌体吸光值(乘以稀释倍数后的OD700)为9～10左右的摇瓶种子接种值装量为5L/7L罐的发酵培养基中，培养条件为罐温(32±0.5)℃、罐压0.05～0.06MPa，通气比1∶1(vvm)，搅拌转速根据发酵过程的溶氧变化进行调整。

1.4 分析方法

1.4.1 菌体生物量测定 采用测量菌体干重法(Dry cell weight，DCW)。吸取10mL发酵液至离心管中，5000r/min离心弃上清液，所得菌体以蒸馏水洗涤两次，80℃下烘至恒重后称量。

1.4.2 溶解氧测定 Mettler Toledo在线溶氧检测系统。

1.4.3 pH测定 Mettler Toledo在线pH检测系统。

1.4.4 维生素B12含量的测定:高效液相色谱法

a.样品制备:取10mL发酵液，加入8%亚硝酸钠溶液和冰醋酸各 2.5mL，摇匀，于 95～100℃水浴30min;水浴后冷却至室温，加去离子水定容至50mL，过滤;所得滤液用0.22μm微孔滤膜针头过滤器过滤1mL至样品瓶中，用微量进样器吸取氰化钠溶液20μL放入样品瓶中，将样品瓶放入35～40℃水浴中反应1h，使发酵液中不同形式的维生素B12转化为氰钴胺素，在给定条件下进行液相色谱分析;

b.高效液相色谱条件:流动相为250mmol/L磷酸水溶液-乙腈(30∶70，v/v);色谱柱为大连依利特Hypersil NH2柱(4.6mm ×250mm，5μm);检测波长为361nm;进样量是20μL;流速为1.7mL/min。

2 结果与讨论

2.1 不同甲基供体对脱氮假单胞杆菌发酵耗氧的影响

分别以氯化胆碱和甜菜碱为合成维生素B12的甲基供体，在7L发酵罐中考察了这两种典型性甲基供体对脱氮假单胞杆菌发酵过程耗氧的影响，结果如图1所示。

图1 氯化胆碱和甜菜碱为甲基供体下的转速和溶氧的动态变化情况Fig.1 Time courses of agitation and DO under using choline chloride(a)and betaine(b)as methyl-donor for Pseudomonas denitrificans fermentation in 7L fermenter

由图1所示的两种甲基供体下的发酵过程溶氧变化趋势可以看出，其发酵前期随着菌体量不断增加，耗氧量也随之增大，均不得不通过提高搅拌转速以增加供氧量。但是，当以氯化胆碱为甲基供体时，发酵液的溶氧在第76h后开始出现明显的回升，这表明脱氮假单胞杆菌的代谢明显变缓。此时，不得不通过降低搅拌转速(由850r/min逐步降低到550r/min)来压制溶氧的回升，但是发酵液的溶氧浓度仍然难以控制在适宜的水平。整个发酵过程不得不在第117h时结束，此时溶氧水平已高达64.6%。

而当以甜菜碱为甲基供体时，尽管搅拌转速一直高达900r/min，但是脱氮假单胞杆菌整个发酵过程的溶氧浓度却一直保持在3%～7%的范围内，并没有像使用氯化胆碱的发酵批次那样出现明显的溶氧回升现象。以上溶氧变化趋势表明，脱氮假单胞杆菌在以甜菜碱为甲基供体进行发酵时，其代谢能力要明显优于使用氯化胆碱作为甲基供体的发酵批次。

2.2 不同甲基供体对脱氮假单胞杆菌菌体生长及产物合成的影响

当脱氮假单胞杆菌分别以氯化胆碱和甜菜碱为甲基供体进行发酵时，其发酵过程的溶氧浓度变化说明二者会对菌体的代谢能力产生一定的差异。为了深入了解这两种甲基供体对脱氮假单胞杆菌代谢过程的影响，进一步测定了这两个发酵批次下的pH、菌体生长和维生素B12合成等发酵参数的变化情况，结果如图2所示。

图2 氯化胆碱和甜菜碱作为甲基供体下的pH、菌体量和维生素B12产量等参数变化趋势Fig.2 Time courses of pH，DCW and vitamin B12under using choline chloride(a)and betaine(b)as methyl-donor for Pseudomonas denitrificans fermentation in 7L fermenter

由图2所示的pH变化可以看出，使用氯化胆碱为甲基供体的发酵批次，其发酵液的pH在第54h后出现剧烈的下降趋势，pH在第96h时甚至降低至5.78。这很可能是由于氯化胆碱作为甲基供体被菌体利用后，致使氯离子不断地积累，因而造成发酵液的pH出现明显的下降。由于甜菜碱又名三甲基甘氨酸，属于两性化合物，水溶液一般呈中性［12］，因此该罐批下的pH变化较为稳定，一直保持在7.15～7.50，并未像使用氯化胆碱的罐批那样pH呈现剧烈的下降趋势。

由图2还可以看出，以氯化胆碱为甲基供体的罐批，其菌体量在第54h后表现出十分缓慢的增加趋势，发酵过程的最大菌体干重仅为28.48g/L;而使用甜菜碱作为甲基供体的罐批，其菌体生长要明显优于使用氯化胆碱的罐批，发酵过程的最大菌体干重达到32.78g/L。

与菌体生长趋势较为一致的是，甜菜碱作为甲基供体更有利于维生素B12的合成。该罐批放罐时(160h)的维生素 B12产量为146.2mg/L，而且在第120h时维生素B12合成量就达110.67mg/L，而以氯化胆碱为甲基供体的罐批在第117h时的维生素B12产量仅为75.49mg/L。

有研究表明，脱氮假单胞杆菌发酵过程的溶氧浓度和pH会对维生素 B12的合成产生显著的影响［13-14］。由于使用氯化胆碱作为甲基供体会造成脱氮假单胞杆菌发酵过程溶氧显著回升以及pH剧烈下降，造成不利于菌体代谢的异常环境。然而使用甜菜碱为甲基供体的发酵过程，却能将溶氧浓度和pH控制在适宜于维生素B12合成的范围内。

3 结论

通过在7L发酵罐中考察使用氯化胆碱或甜菜碱作为甲基供体对脱氮假单胞杆菌发酵过程的影响，可以得出结论:使用氯化胆碱作为合成维生素B12的甲基供体时，发酵液pH会因氯离子的积累而出现明显的下降趋势，而且由于pH剧烈下降导致菌体生长和维生素B12合成受到抑制，最终因菌体代谢异常而造成发酵过程的溶氧过早回升，不得不提前放罐;而使用甜菜碱作为甲基供体时，发酵过程的pH能保持在较为适宜的范围内，使得菌体代谢能力较使用氯化胆碱的罐批更为良好，因而没有出现溶氧回升的现象，最终的维生素B12产量也更高。因此，在脱氮假单胞杆菌发酵产维生素B12的过程中，宜选用甜菜碱作为外源甲基供体。

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