HPLC ELSD同时分离检测食品中十种单糖、双糖和低聚果糖

李 灿，陈 英，李 培，钱 和，姚卫蓉，*

(1.苏州市产品质量监督检验所，江苏苏州215140;2.江南大学食品学院，江苏无锡214122)

糖类一般指多羟基醛、多羟基酮或水解后产生这些化合物的一大类有机化合物［1］，它是生命过程中的主要能量来源［2］。糖类在食品中影响食品质构、风味、稳定性、甜味等性质，同时也是食品中的主要营养素。食品中糖类的种类及含量的多寡直接影响到食品的质量与营养价值［3］。随着人们生活水平的提高，食品工业的发展，人们的膳食结构发生了急剧变化，引发了各种“吃糖”过多所导致的健康问题，如龋齿、肥胖、高血脂、高血压、糖尿病、冠心病等。目前国内对食品中糖含量检测应用和研究较多的方法主要包括化学检测法［4-5］、高效液相色谱-荧光散射检测法［6］、高效液相色谱-示差折光检测法［7-9］、离子色谱法［10］等。但是化学法耗时较长，只能测定总糖和还原糖的含量，无法进行准确的定性定量分析;高效液相色谱-荧光散射法由于需要目的物具有荧光特性，用于糖的检测时需要对其进行衍生化处理，降低了其通用性;目前国标GB/T 22221-2008和GB/T 22222-2008中测定单糖、双糖和糖醇含量采用了高效液相色谱-示差折光法，该法灵敏度较低，且无法进行梯度洗脱，使得其难以用于多种糖的同时分离检测;离子色谱法在糖含量的检测研究中较多，其灵敏度较好，但是糖类在电极表面能将某些分子氧化或还原，从而影响方法的准确性，并且受环境温度的影响。目前尚未见到采用HPLC-ELSD法对十种糖进行同时分离检测的相关报道。针对食品中常见的十种单糖、双糖、低聚果糖，包括木糖、果糖、葡萄糖、半乳糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖，本论文主要拟采用NH2柱进行梯度洗脱分离，并结合新一代的质量型通用检测器-蒸发光散射检测器(Evaporative light-scattering detector，ELSD)进行检测，从而建立高效、准确、快速、灵敏的多种糖类同时分离检测的技术，为糖类的检测、应用和监管提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

6种婴儿配方奶粉、洋槐蜜、蜂蜜、果粒橙、红葡萄汁、乳饮料、番茄汁、芒果果露、月饼、口红棒，牛奶扎糖共16种样品，均来源于苏州市产品质量监督检验所抽检样品;木糖(纯度97.9%)、半乳糖(纯度99.5%)、果糖(纯度 99.5%)、葡萄糖(纯度98%)、蔗糖(纯度 95%)、麦芽糖(纯度 92%)、乳糖(纯度99%)标准品 Dr Ehrenstorfer GmbH，德国;低聚果糖(蔗果三糖99.0%、蔗果四糖99.0%、蔗果五糖80.0%，HPLC级)和光纯药工业株式会社;石油醚(沸程30～60℃，分析纯)天津市大茂化学试剂厂;亚铁氰化钾(99.5%，分析纯)上海凌峰化学试剂有限公司;乙酸锌(99.0%，分析纯)天津市大茂化学试剂厂;三氯乙酸(分析纯)国药集团化学试剂有限公司;乙腈(99.9%，色谱纯)TEDIA公司。

Agilent 1200series高效液相色谱仪、Agilent ZORBAX NH2柱(5μm，4.6×250mm)安捷伦科技有限公司;Alltech 3300蒸发光散射检测器 美国格瑞斯公司;KQ2200超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;XS204电子天平 瑞士梅特勒-托利多;水相针式滤器(聚醚砜，0.22μm)上海安谱科学仪器有限公司;Millipore去离子水器 苏州赛恩斯仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 溶液的配制

1.2.1.1 15%三氯乙酸溶液 称取15g三氯乙酸于150mL烧杯中，用100mL超纯水溶解，转移至棕色试剂瓶，并每月更换。

1.2.1.2 亚铁氰化钾溶液 称取10.6g亚铁氰化钾于150mL烧杯中，取100mL超纯水溶解，后转移至棕色试剂瓶中待用，并每月更换。

1.2.1.3 乙酸锌溶液 称取乙酸锌21.9g，加入3mL冰乙酸，加超纯水定容到100mL，并转移至棕色试剂瓶中备用，并每月更换。

1.2.1.4 单糖、双糖、低聚果糖单标储备液的配制分别准确称取木糖、半乳糖、果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖各0.25g(精确到0.1mg)于150mL烧杯中，用10mL超纯水溶解，超声波振荡2min，转移至25mL容量瓶中，并用超纯水定容至刻度，4℃冰箱保存。

1.2.1.5 单糖、双糖、低聚果糖混合标准工作溶液的配制 分别取配制好的各单标液2mL于25mL容量瓶中，用超纯水定容至刻度，配成各糖浓度均为0.8mg/mL的混标液，4℃冰箱保存，待液相检测。

1.2.2 样品的前处理［8-9］

1.2.2.1 乳饮料 称取乳饮料1～5g(M1，精确到0.1mg)，缓慢加入15%三氯乙酸0.5～3mL，加超纯水定量至 100g(M2，精确到 0.1mg)，40℃水浴 30min，用干燥滤纸过滤，取少量滤液过0.22μm水相滤膜至样品瓶中，待液相检测。

1.2.2.2 配方奶粉 称取奶粉2g(M1，精确到0.1mg)于50mL具塞离心管中，加入45mL石油醚(沸程30～60℃)，振荡 2min后 8000r/min 离心 5min，弃去石油醚，重复以上操作至去除大部分脂肪，弃去石油醚，氮吹挥干残留石油醚后转移至150mL烧杯中，用20mL超纯水分两次清洗离心管，并将清洗液转移至烧杯中，加入亚铁氰化钾和乙酸锌溶液各3.5mL，加超纯水定量至50g(M2，精确到0.1mg)，40℃水浴30min，用干燥滤纸过滤，取少量滤液过0.22μm水相滤膜至样品瓶中，待液相检测。

1.2.2.3 蜂蜜、果蔬汁饮料 称取蜂蜜、果蔬汁饮料1～50g(M1，精确到0.1mg)于150mL烧杯中，加超纯水定量至 100g(M2，精确到 0.1mg)，超声波振荡5min，用干燥滤纸过滤，取少量滤液过0.22μm水相滤膜至样品瓶中，待液相检测。

1.2.2.4 月饼 称取粉碎处理后的月饼2g(M1，精确到0.1mg)于50mL具塞离心管中，加入45mL石油醚(沸程30～60℃)，振荡2min，8000r/min 离心5min，弃去石油醚，重复以上操作至去掉大部分脂肪，挥干(氮吹)残余石油醚，将月饼转入150mL烧杯中，加入亚铁氰化钾和乙酸锌溶液各3～5mL，用超纯水定量至100g(M2，精确到0.1mg)，超声波振荡30min，干燥滤纸过滤，取少量滤液过0.22μm水相滤膜至样品瓶中，待液相检测。

1.2.2.5 糖果(如口红棒、牛奶扎糖)称取粉碎的硬质糖果1g(M1，精确到0.1mg)至150mL烧杯中，加超纯水定量到100g(M2，精确到0.1mg)，超声波振荡5min，干燥滤纸过滤，取少量滤液过0.22μm水相滤膜至样品瓶中，待液相检测。

1.2.3 液相检测条件

1.2.3.1 高效液相色谱分离条件 色谱柱:Agilent ZORBAX NH2柱(5μm，4.6 ×250mm);柱温 30℃;流动相:A:乙腈，B:水;梯度洗脱程序见表1，流动相流速 1mL/min，进样量10μL。

表1 混合标准溶液的梯度洗脱程序Table 1 The elution gratitude program of standard mixed solution

1.2.3.2 蒸发光散射检测器检测条件 漂移管温度为60℃，载气为氮气，载气流速为1.2L/min，增益为1。

1.2.4 糖含量的计算 将色谱图中各糖的保留面积代入该糖的标准曲线方程，计算该糖在样液中的浓度C(mg/g)。

式中:X为样品中糖含量(%)，C为样品提取液中糖的含量(mg/g)，M1为样品质量(g)，M2为定量质量(g)。

2 结果与讨论

2.1 混合标准溶液的HPLC－ELSD分离检测

2.1.1 液相条件的选择 糖类检测较常用的柱子有NH2柱，钙型阳离子柱，由于对多种糖标液进行同时分离时，依据不同糖分子与NH2柱形成氢键结合力的强弱不同，在分离时更具有优势，因此，选择了NH2柱，同时流动相选择乙腈-水。通过改变乙腈-水的比例(见图1)，发现各种糖的保留时间会发生显著变化，并且随着水的比例的增加而保留时间不断缩短，当以乙腈水为75∶25(条件A)等度洗脱时，发现10种物质保留时间较相近，其中果糖、葡萄糖、半乳糖三者保留时间接近，无法完全分离，这可能与三者相近的分子结构以及形成氢键的能力有关;当乙腈水比例分别以80∶20和75∶25的等度洗脱时(条件B)，可以发现10种物质的保留时间增大，但这三种物质仍无法分离;当乙腈水比例从80∶20渐变到87∶13，再从 87∶13 渐变到 75∶25 并保持时(条件C)，发现分离效果变佳，但葡萄糖和半乳糖这两种同分异构体仍无法分离;条件D时的分离效果则不如条件C。通过对四种梯度洗脱条件进行比较发现，当加大水的比例时，各物质的保留时间增大，保留时间相近物质的分离度增大，但是葡萄糖和半乳糖由于属于同分异构体，分子内含羟基数目相同，仍不能较好分离，但可以发现葡萄糖的保留时间比半乳糖稍小，可以通过尝试在两者被洗脱时间之前增大乙腈比例，将两者被洗脱时间延长从而实现两者的完全分离，并在洗脱后期增加水的比例从而加快低聚果糖的洗脱，缩短整体的分离时间。最后在条件C的基础上对流动相比例随时间变化进行细微调整后，终于可实现以上10种糖的较好分离，此时混合标准溶液梯度洗脱顺序如表1所示。

2.1.2 蒸发光散射检测器(ELSD)条件的优化ELSD的两个较重要的参数分别是漂移管温度和载气流速，两者对组分的保留时间影响较小，但是对信噪比(S/N)影响较大，一般建立适当的HPLC-ELSD分析方法时，必须对这两个参数进行优化。其中漂移管温度对基线与噪音的影响并没有明显的规律，优化的原则一般是选择在达到最佳信噪比时的最低漂移管温度，因为漂移管温度越高，流动相趋向沸腾，会逐渐降低信噪比;最佳的载气流速是在可接受的噪音的基础上，产生最高检测响应值的最低流速;综合以上考虑，经过摸索(见图2)，确定最佳漂移管温度为60℃，最佳载气流速为1.2L/min。

图1 四种不同梯度条件下得到的混合标准溶液色谱图Fig.1 Chromatogram of mixed standard solution with four different elution gratitude

图2 不同漂移管温度和不同载气流速时混合标准溶液的色谱图Fig.2 Chromatogram of mixed standard solution in different drift temperature and different carrier gas flow rate

最终确定混合标准溶液分离的最佳条件如1.2.3所示，此时混合标准溶液色谱图如图3所示。

表3 十种糖的标准曲线方程、线性范围、线性相关系数、检出限Table 3 Standard curve equation，linear range，linear correlation coefficient，detection limit of ten sugars

表4 混合标准溶液HPLC-ELSD分离检测的精密度实验Table 4 Precision test of HPLC-ELSD separation and detection of mixed standard solution

图3 混合标准溶液的HPLC-ELSD分离色谱图Fig.3 HPLC-ELSD separation chromatogram of mixed standard solution

2.2 混合标准溶液的标准曲线方程、线性范围、线性相关系数及检出限

将10mg/mL的各种糖标准溶液依次稀释为5、3、2、1、0.5、0.1、0.05mg/mL 的梯度标准溶液，在 1.2.3的液相检测条件下检测，根据各糖梯度溶液的峰面积(Y)对浓度(X)进行线性回归，得到十种糖的标准曲线方程、线性范围、线性相关系数，结果见表3。依次将糖标液浓度不断稀释至谱图中信噪比为3时，此时浓度为该糖的检出限，结果见表3。

2.3 混合标准溶液HPLC－ELSD检测的精密度实验

将混合标准溶液分别在1.2.3的液相检测条件下进样6次，根据各组分的峰面积变化确定液相分离检测的精密度［11］，结果表明十种糖的相对标准偏差均在1.71%～7.21%之间，表明该法的精密度较高，结果见表4。

2.4 方法的加标回收率考察

选择3种样品，分别加入1.2.1.4中配好的不同体积的各种单标液，进行加标回收率实验，在1.2.3的分离检测条件下，测得各组分的平均回收率均在97.91%～103.35%之间(表5)。结果表明该方法的准确度较高，可以用于实际样品的检测。

续表

2.5 实际样品分析

采用本研究中建立的方法，对16种实际样品进行检测，检测结果见表6，部分样品分析色谱图见图4。

3 结论

本研究建立了对食品中木糖、果糖、葡萄糖、半乳糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖等十种糖同时分离检测的高效液相色谱-蒸发光散射检测法。研究结果表明，该检测方法具有较宽的线性范围，精密度和准确度良好，将其用于食品中以上10种糖的测定时，具有较好的通用性;本法能为糖类食品生产企业的质量控制和质检部门的市场监督提供科学依据，同时也能作为单糖、双糖、低聚果糖同时分离检测国家标准方法的基础。

图4 部分实际样品分析色谱图Fig.4 Analysis chromatogram of part real samples

表6 16种食品中糖含量的检测结果(mg/g)Table 6 Detection results of sugar contents in 16 kinds of food

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