细薄星芒海绵总萜烯对小鼠经口及腹腔给药急性毒性试验

张佳佳,巫 军,林厚文

(1.浙江医药高等专科学校,浙江宁波315200;2.宁波拜奥生物医药科技,浙江宁波315201;3.第二军医大学长征医院药学部,上海200003)

细薄星芒海绵(Stelletta tenuis Lindgren)属寻常海绵纲(Demospongiae)、星骨海绵目(Astrophorida)、星芒海绵科(Stellettidae)星芒海绵属(Stelletta)动物,该物种在我国从福建东山到西沙群岛的海域均有广泛分布[1]。我们以稻瘟霉模型和体外细胞毒模型跟踪筛选,将细薄星芒海绵中的具有抗癌活性的一系列异玛拉巴烷(isomalabaricane)型三萜化合物命名为海绵总萜烯(STS),研究发现,该物质体内外均显示明显的细胞毒活性,尤其对HL-60细胞株有强细胞毒活性,IC50<10-3mg/L。本课题进行了STS对小鼠经口、腹腔给药急性毒性的研究,为临床用药提供依据。

1 实验材料

1.1 海绵 细薄星芒海绵(Stelletta tenuis Lindgren)采自我国南海三亚周边海域,由中国科学院海洋研究所李锦和研究员鉴定为正品。

1.2 实验动物 清洁级昆明种小鼠,体质量19～23 g,雌雄各半,上海复旦大学实验动物科学部提供。

2 实验方法

2.1 腹腔注射急性毒性试验 选用清洁级健康小鼠50只(上海复旦大学实验动物科学部),雌雄各半,适应环境3 d后进行试验。小鼠体质量为 18.5～21.4 g。按随机均衡原则将小鼠均分为5组。按已设置的剂量分别对各组小鼠腹腔注射。试验前动物禁食16 h,不限制饮水。给药后4 h内严密观察并记录,随后每天上、下午各 1次,连续观察14 d,详细记录小鼠中毒表现及死亡情况。对死亡动物进行尸检。按改进寇氏法计算所试药物的LD50值。[2]

2.2 经口急性毒性试验 取清洁级健康小鼠70只(上海复旦大学实验动物科学部),体质量18～22 g,禁食12 h(供水),按体质量随机分成7组,每组10只,雌雄各半,按10 mL/kg体质量的容量经口给药,各组小鼠的给药浓度分别为0.200、0.160、0.128、0.102、0.082、0.066、0.053 g/mL,以 0.5%CMC-Na 配制,用Bliss法计算LD50及其95%可信限。观察14 d内动物毒性反应情况和死亡情况,包括中毒症状,中毒发生时间、持续时间、恢复时间及动物死亡时间等[3]。

3 实验结果

3.1 腹腔注射急性毒性试验 试验结果显示,海绵总萜烯对小鼠具有一定的毒性作用,且随着剂量的增大,其毒副作用也相应增强,有剂量效应关系。当给药剂量为300 mg/kg体质量时,小鼠即已出现中毒症状,主要表现为运动力下降、发绀。当给药剂量大于300 mg/kg体质量时,小鼠出现死亡。由改良寇氏法得到海绵总萜烯的半数致死量(LD50)为450 mg/kg体质量,其95%的可信区间为409～495 mg/kg体质量,结果见表1。

3.2 经口急性毒性试验 给药后24 h内动物活动自如,毛紧贴身,有光泽,进食饮水正常,粪便及其它情况均未见异常。动物死亡发生在给药后的第2～6天内,动物死亡前安静少动,耸毛,毛色无光泽,拒食拒水,肛门口有褐色粪便残留物。死亡动物经尸检肉眼观察未见明显病理改变(结果见表2～4)。

表1 海绵总萜烯小鼠腹腔注射急性毒性结果及LD50计算(n=10)

表2 海绵总萜烯经口给药对小鼠急性毒性死亡频数表(n=10)

表3 海绵总萜烯经口给药对小鼠急性毒性体质量变化±s,n=10) g

表3 海绵总萜烯经口给药对小鼠急性毒性体质量变化±s,n=10) g

注:a表示n=3,b表示n=4,c表示n=5,d表示n=7,e表示n=8。

剂量/(g/kg)体质量给药前 第7天 第14天2.00 20.45±0.78 1.60 20.60±0.88 18.90±1.65a 26.27±3.46a 1.28 20.68±0.62 18.50±0.22b 26.88±3.17b 1.02 20.61±0.93 19.78±0.84c 27.92±0.69c 0.82 20.58±0.85 19.69±4.61d 27.97±3.51d 0.66 19.94±1.25 19.04±1.58e 28.71±1.98e 0.53 19.87±0.74 19.79±0.70 0.59±3.05

表4 海绵总萜烯经口给药对小鼠的急性毒性观察结果(n=10)

4 小结

海绵总萜烯(STS),其化学组成清楚,产品纯度高(海绵总萜烯的含量达到80%以上),产品得率高(约0.3%),动物体内外试验都表现出很好的抗肿瘤活性,对裸鼠A549肺癌和裸鼠结肠癌LS-174T模型有显著的抗肿瘤作用,高剂量组(8 mg/kg体质量,灌胃;4 mg/kg体质量,腹腔注射)对肿瘤的抑制率分别达到78%和82%。本实验结果表明:小鼠灌胃海绵总萜烯的LD50为1.08 g/kg体质量,小鼠腹腔注射海绵总萜烯的LD50约为0.45 g/kg体质量,约相当于最大治疗剂量的125倍,初步推断STS属于低毒物质,口服给药较为安全。

[1]王增蕾,张红军,林厚文,等.星芒属海绵次生代谢产物及其生物活性[J].中国海洋药物,2004,23(6):42-47.

[2]王增蕾,熊巍,林厚文,等.南海细薄星芒海绵抗肿瘤活性成分研究(Ⅱ)[J].中国海洋药物,2006,25(4):11-16.

[3]陈建涛,杨帆,张红军,等.海绵 Haliclona oculata化学成分的研究[J].药学实践杂志,2010,28(1):52-54.

[4]王治乔,袁伯峻.新药临床前安全性评价与实践[M].北京:军事医学科学出版社,1997:23-24.

[5]张艳,孙志伟.参茸龟芪口服液的毒理学安全性评价[J].吉林中医药,2005,25(4):49-50.

[6]丁青龙,李莹,徐连明.夜宁胶囊毒理学试验研究[J].吉林中医药,2008,28(3):217-218.