碱性果胶酶生产菌株的产酶条件优化

殷智超，金俊成，王修坤，张珍林

（1.皖西学院 生物与制药工程学院，安徽 六安237012；2.皖西学院 材料与化工学院，安徽 六安237012；3.六安市人民医院 烧伤整形外科，安徽 六安237005）

果胶酶是一类能够分解果胶质的复合酶类，在微生物及植物果实中广泛存在，一般主要由果胶裂解酶（PL）、果胶酯酶（PE）和聚半乳糖醛酸酶（PG）等组成，人们通常提到的果胶酶是多种分解果胶的酶类总称［1］。

碱性果胶酶是指碱性条件下具有较高酶活性的果胶酶。果胶酶一般应用于果汁预处理等酸性条件，大部分果胶酶也只在酸性条件下具有高的酶活性。近年来，在一些碱性环境下，果胶酶也开发出较多的应用，例如其在棉纺织预处理中的应用，引起了人们的广泛关注［2］。随着环保健康纺织品需求量的加大以及环境保护力度的增加，在纺织印染行业中，一种应用碱性果胶酶的新型纺织生物助剂在纺织印染行业中正应用推广［3］。另外，碱性果胶酶应用于洗涤剂、植物药物提取、生物技术、造纸等行业也成为研究的新热点，受到越来越多的关注［4］。本文对自行筛选的碱性果胶酶生产菌进行产酶条件的优化，以求得到能在碱性条件下具有较高活性的果胶酶，为碱性果胶酶在工业中的应用提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

材料：自行从土壤中筛选得到的菌株G3，初步鉴定为黑曲霉（Aspergillus niger）。

斜面培养基 （w/v）：牛肉膏 0.3%、蛋白 胨1.0%、NaCl 0.5%、琼脂1.8%，自来水定容，并调节pH＝7.4。

种子培养基（w/v）：果胶0.2%、MgSO40.05%、NaNO30.3%、K2HPO40.01%、FeSO40.001%、琼脂1.8%，自来水定容，并调节pH＝7.4。

初始产酶培养基（固体发酵）：果胶1.0%、NaNO30.5%、MgSO40.05%，自来水定容，并调节pH至7.4，以固液质量比1∶1加入固体基质木屑。

1.2 仪器

752型紫外可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；PHX智能型生化培养箱，宁波莱福科技有限公司；GZX－9240MBE型电热恒温水浴锅，国华电器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 培养方法

取斜面活化的孢子一环，接入50mL种子培养基，28℃、120r/min摇床振荡培养24h，然后以5%（v/w）的接种量将种子液接种到产酶培养基中，将固体培养基打散，与种子液混匀，静置恒温培养箱，28℃培养5d。

1.3.2 粗酶液提取

向产酶培养基中加入2倍质量的0.85%NaCl溶液，震荡以充分混匀，静置2h后以6层纱布过滤，过滤液为粗酶液。

1.3.3 酶活测定

采用3，5－二硝基水杨酸法（DNS法）［5］。加入1 mL 5g/L的果胶溶液，加入1mL pH10.0的甘氨酸－氢氧化钠缓冲液，加入1mL待测酶液，摇匀，水浴锅40℃恒温反应30min，取出试管迅速冷却以终止酶反应。加入1mL DNS试剂摇匀，沸水浴反应5 min，取出迅速冷却。加20mL蒸馏水稀释，并以沸水浴加热失活的粗酶液作空白对照，测定540nm下混合液的吸光度。

酶活定义：以果胶为底物，40℃，pH＝10.0条件下，定义1mL酶液60min催化果胶水解，每生成1 μg半乳糖醛酸为一个酶活力单位，用U表示。

1.3.4 单因素实验

控制其他初始产酶培养基条件不变，使果胶的含量分别为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%，进行发酵产酶，提取粗酶液，测定果胶酶活力。

控制其他初始产酶培养基条件不变，使NaNO3的含量分别为0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%，进行发酵产酶，提取粗酶液，测定果胶酶活力。

控制初始产酶培养基条件不变，分别按照接种量2%、4%、6%、8%、10%进行接种，发酵产酶，提取粗酶液，测定果胶酶活力。

1.3.5 正交试验

采用三因素三水平的正交试验方法讨论果胶、NaNO3及接种量对发酵产生果胶酶酶活力的影响。设计方案见表1。

表1 果胶酶发酵条件优化正交试验表

1.3.6 验证试验

以正交试验结果中的最优组合作为提取条件进行实验，计算果胶酶酶活。

2 结果与分析

2.1 果胶含量对发酵结果的影响

不同果胶添加量的发酵结果见图1。

由图1可知，果胶含量为0.2%时，酶活力最强。

图1 果胶添加量对发酵产酶的影响

2.2 NaNO3含量对发酵结果的影响

不同NaNO3添加量的发酵结果见图2。

图2 NaNO3添加量对发酵产酶的影响

由图2可知，NaNO3含量为0.8%时，酶活力最强。

2.3 接种量对发酵结果的影响

不同接种量的发酵结果见图3。

图3 接种量对发酵产酶的影响

由图3可知，接种量为6%时，酶活力最强。且继续增加接种量，酶活会大幅度降低，可能是因为接种时孢子数量过多，导致菌种初期生长营养匮乏，后期总菌量降低，从而使酶活降低。

2.4 正交试验及验证试验结果

正交试验的结果如表2所示。

由正交试验结果（表2）可知，3个因素中对发酵生产果胶酶影响的主次顺序为接种量＞果胶添加量＞NaNO3添加量；其中接种量的影响最大，为主要因素，果胶添加量影响其次，NaNO3添加量影响最小；最优产酶发酵条件组合为：果胶添加量0.3%，NaNO3添加量0.6%，接种量6%。

验证实验测得结果为：果胶酶酶活力为6 079U/mL。

表2 正交试验结果

3 讨论

本文采用单因素和正交设计试验优化了碱性果胶酶的生产工艺，研究了果胶添加量、NaNO3添加量及接种量对发酵生产果胶酶的影响。最佳发酵条件为果胶添加量0.3%、NaNO3添加量0.6%、接种量6%。此配比下果胶酶酶活力为6 079U/mL。在采用诱变等其他方法进一步提高产酶酶活后，将探讨制作酶干粉制剂，并研究其果胶酶酶活。

［1］王步江，姜丹，涂然.嗜热碱性果胶酶产生菌的筛选及产酶条件优化［J］.食品与发酵工业，2012，38（5）：117－121.

［2］Kashyap D R，Vohra P，Chopra S.Biotechnologiical Applications of Microbial Pectinases［J］.Bioresource Technology，2001，（77）：215－227.

［3］李建洲，李江华，许正宏，等.嗜盐嗜碱菌Alkalibacteriumsp.F26产碱性果胶酶发酵条件的优化［J］.食品与生物技术学报，2005，24（6）：43－48.

［4］刘曦，路福平，黎明，等.碱性果胶酶高产菌株产酶条件的优化［J］.生物技术，2008，18（6）：71－74.

［5］江洁，刘晓兰.果胶酶活性分光光度计测定方法的研究［J］.齐齐哈尔大学学报，1998，（1）：63－66.