高效液相色谱测定益智仁中的牛磺酸含量

叶思平，陈悦娇，陈海光*，邓雅哲

(仲恺农业工程学院轻工食品学院，广东 广州 510225)

益智仁别名益智子，是姜科山姜属植物益智(Alpinia oxyphylla Miq.)的干燥果实，夏、秋间果实由绿变红时采收，晒干或低温干燥。益智仁具有强心、抗癌、控制回肠收缩等功效[1]，由于其味辛性温，气味芳香，常被制成益智棕、蜜饯、粥、饮料等食品，具有开胃、健脾、促进食欲、帮助消化的作用。邸磊等[2]研究表明，益智仁中含有二芳基庚烷类、黄酮、甾体、有机酸等成分。

据报道，益智含有大量的“聪明因子”——牛磺酸，但益智仁中是否含有牛磺酸在相关文献中却没得到证实。本实验用高效液相色谱法测定益智仁中牛磺酸含量，为益智仁功能食品的开发应用提供参考意见。

目前，牛磺酸测定方法有荧光法、氨基酸自动分析法、高效液相色谱法等，而前两种方法的仪器价格较贵、运行成本较高。本实验拟采用高效液相色谱法对益智仁中牛磺酸含量进行测定。高效液相色谱法主要有2,4-二硝基氟苯(DNFB)衍生法、单磺酰氯(Dansyl-Cl)衍生法、邻苯二甲醛(OPA)衍生法等，但前两者应用试剂较多，且试剂价格昂贵，所以本实验选用实验条件最简便的邻苯二甲醛衍生法。有关柱前衍生高效液相色谱法测定牛磺酸含量已有资料报道[3-4]，采用梯度洗脱测定，费时较长；国家现行标准[5]中，流动相为甲醇-乙腈-水(10：10：80，V/V)时，较难洗脱导致峰型不佳。本实验采用邻苯二甲醛作为衍生剂，甲醇-醋酸钠作为流动相，拟建立测定结果准确，峰型良好，而且便于操作的益智仁中牛磺酸含量的方法。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

海南益智仁 市购。取10g益智仁，粉碎后过40目筛，加约200mL纯净水，浸泡30min，煮沸后保温30min，定容至250mL，过滤，滤液作为测定样品。

牛磺酸(纯度＞98%)、邻苯二甲醛(OPA)、甲醇(色谱纯)、四氢呋喃、硼酸、氢氧化钠、磷酸二氢钾、无水乙酸钠、乙硫醇分析纯、水为二次蒸馏水。

衍生剂配制：称取0.05g邻苯二甲醛，用1mL甲醇溶解，加入0.1mL乙硫醇，用硼酸缓冲液(0.4mo1/L、pH9.5、NaOH调制)定容至10mL，密封后在冰箱中(0～4℃)避光保存；牛磺酸标准溶液：准确称取0.05g牛磺酸用pH7.5磷酸缓冲液定容至50mL，即含牛磺酸1mg/mL；牛磺酸标准使用液：吸取牛磺酸标准溶液1mL于50mL容量瓶，用磷酸缓冲液定容至刻度，即得0.020mg/mL牛磺酸标准使用液。

1100高效液相色谱仪 美国安捷伦科技公司；KQ5200超声波清洗器 昆山市超声波仪器有限公司；PHB-4型便携式数字pH计 上海精密科学仪器有限公司；TG16-W微量高速离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司；XB224电子精密天平 上海精科天美科学仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 样品处理

移取益智仁样品20mL于小烧杯中以0.2g活性炭脱色，过滤取4mL于离心管中，1000r/min离心15min，取上清液用微孔虑膜过滤备用。

1.2.2 色谱条件

色谱柱：Eclipse XDB-C18反相柱(150mm×4.6mm，5μm)；流动相：甲醇-0.05mol/L醋酸钠(65：35，V/V)；流速：1.0mL/min；检测波长：330nm；进样体积：10μL；柱温；27℃。

2 结果与分析

2.1 波长选择

根据牛磺酸测定的国家标准，牛磺酸在波长为330nm有最大吸收峰，所以本实验采用330nm为测定波长。

2.2 流动相配比选择

分别选择不同配比的流动相，进行牛磺酸标准样和实际样品的色谱分离实验，选用甲醇与0.05mol/L的乙酸钠作为流动相，分别选择体积比为55：45、65：35、75：25进行实验，实验证明在流速为1.0mL/min下，随着流动相中甲醇比例的增加，磺酸的出峰时间明显提前，甲醇-0.05mol/L乙酸钠(65：35，V/V)的流动相出峰时间为8min左右，分离效果最佳。而体积比为55：45时，出峰时间在20min左右，衍生物已经分解，峰值较小，不宜选择。当比例为75：25时，由于出峰时间在3min左右，出峰时间较早，影响样品出峰，故选用甲醇-乙酸钠溶液(65：35，V/V)最佳。而新鲜配制的0.05mol/L乙酸钠溶液pH值为6.5，可直接使用。

2.3 衍生剂用量的选择

分别选择不同用量的衍生剂，对牛磺酸标准样和样品进行色谱分离实验。选用10μL质量浓度为0.02mg/μL的牛磺酸标准溶液，分别与5、10、20、30μL衍生剂混合(即牛磺酸标准样和实际样品或衍生剂的比例为2：1、1：1、1：2、1：3)，观察其峰面积与峰型之间的关系，确定衍生剂与标准液的最佳比例。实验证明，随着衍生剂的用量增大，峰面积也逐渐增大，但1：2和1：3的峰型较宽而且出现裂缝现象，所以选用标准液与衍生剂的比例为1：1最佳。

2.4 衍生时间的选择

本实验尝试了标品样品与衍生剂手动混合、在线自动混合等不同衍生条件。结果表明，样品与衍生剂在线自动混合可精确控制衍生时间，而且具有衍生反应迅速、灵敏度高，易于实现自动化操作，可编序列连续进样等优点。但自动混合次数过多，会导致衍生剂挥发，影响分离效果。自动混合2次(约30s)，保证1.5min内进样，其测定效果良好，所以本实验采用衍生时间为30s。

2.5 工作曲线

高效液相色谱仪进样器吸取质量浓度为0、0.004、0.01、0.02、0.04、0.08、0.12、0.16、0.2μg/μL牛磺酸标准溶液10μL，再分别吸取10μL衍生剂，混针2次后进样，进行HPLC分析，每种分析测定3次，取平均峰面积。在牛磺酸的质量浓度4～58mg/L，牛磺酸的质量浓度与色谱峰面积之间回归方程为y=1328.03x－47.13，R2=0.9992，结果见图1。所有试样以及标准从反应至进样及标准反应至进样的时间应保持一致。

图 1 牛磺酸标准色谱图Fig.1 Chromatogram of taurine standard

2.6 精密度测试

吸取质量浓度0.16μg/μL标准溶液，连续测定6次，牛磺酸峰面积的RSD值为0.94%。取同一批样品，按样品溶液项制备6份，测定牛磺酸峰面积，其RSD为1.01%。

2.7 样品的测定

取1.2.1节所配制的样品溶液，按照上述的实验方法进行衍生和色谱分析，记录标准液和样品峰面积，由峰面积外标法定量，测定结果为益智仁的牛磺酸平均为含量363.0mg/kg，结果见图2。

图 2 样品色谱图Fig.2 Chromatogram of sample

2.8 加标回收率实验

在已知含量的样品中加入3个水平的标准溶液，按照上述实验方法和色谱条件进样，计算回收率，平均回收率为104.2%，RSD为2.15%，测定得到的加标回收率见表1。说明本方法较准确。

表1 回收率测试结果Table 1 Recovery of the HPLC method

3 结 论

本实验建立高效液相色谱测定益智仁中牛磺酸含量的方法。以甲醇-0.05mol/L的醋酸钠为流动相，UV-330nm为DAD检测波长。测定结果表明益智仁中牛磺酸的含量大约363.0mg/kg，其含量较少，可能在制作过程中牛磺酸的提取率较低，应从提取工艺上进行改进，以提高益智仁中牛磺酸的含量。另外，由于益智仁气味芳香，味辛性温，而且具有有开胃、健脾功效，可开发成其他保健食品。测定益智仁中牛磺酸的质量浓度时，本实验方法具有分离效果好而且操作简便，灵敏度高，结果准确等优点，适合一般实验室分析。

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