PMA在RT-PCR检测药品细菌污染中的应用

应国红，王晓冲，李 军，王晓炜*，周继昌

（1.深圳药品质量标准研究重点实验室，深圳市药品检验所，广东 深圳 518000；2.深圳市慢性病防治中心，广东 深圳 518000）

注射用药品、生物制品中细菌污染可致患者出现热原反应，严重会引起脓毒血症、败血症、内毒素中毒甚至死亡。随着分子生物学发展，国内外学者将实时荧光定量PCR技术（RTPCR）引入微生物检测中，缩短检测时间，提高灵敏度[1-2]。然而，此法缺点是不能区分所检测到细菌是活细胞还是死细胞，样品中死菌及基因组会产生干扰，导致假阳性结果，造成实际应用困难。

叠氮溴化丙锭（PMA）是一类对DNA具有高度亲和力光敏DNA染料，经PMA前处理后样品暴露于强光下时，PMA与DNA分子共价结合，阻断DNA分子PCR扩增[3]。利用PMA特性，将PMA与实时荧光定量PCR（RT-PCR）技术相结合，能够选择性抑制药品中死菌DNA扩增，有效避免假阳性结果。目前，关于PMA与RT-PCR相结合检测活菌报道很少，多集中于某种单一致病菌[4-5]，在实际应用中，样品中可能含有不同种类死菌，不同种类微生物因其细胞膜及细胞壁结构差异，最适宜PMA浓度不同，本研究将PMA与RT-PCR相结合，以金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌分别做为革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌为考查对象，在证实PMA区分死菌/活菌能力基础上，研究PMA可同时抑制革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌死菌DNA PCR扩增最佳浓度、曝光时间，从而建立一种快速、有效区分药品中死/活细菌方法，应用于药品中污染细菌PCR检测。

1 材料与方法

1.1 菌株

金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003-5a9，大肠埃希菌CMCC（B）44102-3a8，均购自中国食品药品检定研究院。……