浅谈菌种的退化及有效包藏方法

姚卫红 张丽娜 刘美秀

四川省雅安市食品药品检验所，四川雅安 625000

1 菌种退化的主要表现

某一菌种如果在整体性能方面变得恶劣，并且这种变异并非由外界因素引起并遗传给下一代，则成为菌种退化。菌种退化的具体表现一般有以下几点：菌丝变得稀少，子实体原基的产量降低；菌种产生无性孢子的能力大幅度改变。菌种色香产生异变：色素量大幅度增加或减少，甚至由产出色素变为不产出色素，或者出现色素异常现象。代谢产物的变化：菌丝变稀，菌球变少，毛刺少，易老化，空泡增加，培养周期变长。

2 菌种退化的原因

2.1 病毒感染

在菌株的长期使用中，菌丝体或者组织体感染了病毒，在菌种细胞与染色体内同步复制，病毒颗粒因此形成一种感染潜伏，或称平衡状态。一旦变化的条件打破了这种平衡，则会引起菌丝生长速度减缓，菌丝细弱，气生菌丝产量降低，不能够彻底分解养料而出现木屑原色等现象。

2.2 营养不良

现在斜面试管PDA培养基是微生物的万能培养基，其培养方法大同小异，多用木屑添加米糠或者麦麸等等。但是，如果长期使用基本相同的培养基，对于菌株来说往往满足不了其营养上的生理要求，长此以往必定造成菌种的营养不良。或者因为菌种培育时间的不恰当导致培养基内养分耗尽，因此菌丝生长的活力大打折扣，导致菌种的退化。

2.3 无限传代

母种生产中，分离出来的菌种直接应用于生产，有的对扩大母种无限制地传代、无限制地转管，转管越多，创伤越多，频繁无性繁殖一般都是负变异占绝对优势[1]。这种无限传代方面的变异积累到一定程度就会影响到菌丝的质量和产量，并且能够遗传给后代菌种。

2.4 菌种保藏不当

菌种的保藏是保证菌种质量、减缓菌种退化的重要方法，因而菌种的保藏不当很容易造成菌株的退化。目前保存菌种的方式很多，但都存在着导致菌种退化的潜在可能性。通常基因型改变在微生物中的突变率为10-5-10-7。基因突变的几率虽然很大，但是也有可能是因为菌种保藏不当而造成的退化。

3 菌种的有效保藏

3.1 研究菌种退化与保藏的意义

随着菌种保藏时间的延长或者菌种的多次转接传代，菌种本身的细胞特质有可能产生变化，或者延续优良的基因性状，或者产生变异，菌株的退化对于菌种的生产和发展十分不利，因此，研究菌种退化与保藏的意义就在于延续菌种的优良性状，保障菌种的质量和产量，提高经济效益。

3.2 菌种保藏的目的和原理

菌种保藏的目的在于确保菌种的质量，保证其不被污染，不产生变异，不死亡，以便达到使用、研究和交换等诸多方面的需求。菌种保藏的基本原则首先在于对菌种质量的筛选，务必选择质量优良的纯种典型菌种进行保藏。其次，创造适合的保藏条件，以干燥、缺氧和低温为原则，确保微生物长期处于生长繁殖受到抑制的休眠状态，保证其不变质的前提下令其保持代谢不活泼的情况。

3.3 菌种的有效保藏方法

3.3.1 低温保存法 ①简单保存。首先制作孢子培养物，将菌丝悬浮液提炼出来，并用大米、小麦、麦麸等谷物原料制成营养基，并以琼脂斜面密封。将孢子培养物放置在4℃的冰箱内保存，时间约为1～2个月。或者使谷物原料配置的孢子培养瓶处于真空状态，并且在棉塞上浸蜡，以将外界的水汽和空气隔绝出去，则保藏时间可以达到3～4个月。②超低温保存。大多数微生物如多种细菌、放线菌、酵母和原虫、病毒、噬菌体等都可以选取液氮超低温保存的方式进行保藏，因为此类微生物不适用于简单的冷冻干燥法。具体方法是将长期稳定的细胞悬浮液在10%的甘油或者其他低冰点液体中，在试管内密封后迅速冷却，将试管温度下降至-35℃，然后保藏在-150～-196℃的液氮罐或其他超低温环境中[3]。

3.3.2 脱水保存法 ①冷冻干燥法。冷冻干燥法可将孢子悬浮液与保护剂混合，一般可选取血清或脱脂牛奶进行混合，放置于-20～-30℃的乙醇液体中速冻。然后将安培管内的空气在低温下抽干，并用干冰或五氧化二磷冻结水汽，将安培管熔封，低温保存时间可达5～10年。②石蜡油封存法。石蜡封存法的保存期为一年以上，但是不能用于以石蜡油作为碳源的微生物，具体方法是将杀菌后的石蜡油倒在斜面菌种培养物上，高出斜面1厘米左右，放置在4℃冰箱内或低温干燥处保藏。③沙土保藏法。沙土保藏法适用于放线菌、霉菌以及能产生孢子的细菌，保藏时间可达到5～7年。将沙与土以3：2的比例混合，用稀硫酸洗净过筛处理，装入试管内，高度为1 cm左右。进行2～3次灭菌，烘干，之后选取生长茁壮的孢子，用2～2.5 mL无菌蒸馏水制作成悬浮液，吸取适量孢子悬浮液滴入沙土试管，并进行真空抽干，使其外观呈现松散状态，放置于4℃冰箱内保存。

[1] 李红，肖千明，刘娜，等.食用菌菌种退化原因分析及复壮方法的探讨[J].辽宁农业科学，2010（5）：57-59.

[2] 夏凤娜，胡惠萍，邵满超，等.蛹虫草菌种五种保藏条件的保藏效果对比试验[J].食用菌，2010，32（5）：33-34.

[3] 宋越冬.蛹虫草鲁山株C0511菌丝液体培养条件[J].食用菌学报，2010，17（1）：52-54.